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摘要
目的研究卫矛茎皮醇提取物(EAT)和卫矛翅翘醇提取物(EAW)抗四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的作用, 并初步探讨其可能机制。方法选取60只C57BL/6小鼠, 按随机数字表法随机分成健康对照组、模型组、EAW低剂量组、EAW高剂量组、EAT低剂量组、EAT高剂量组, 每组10只。从造模前3 d开始, EAT低、高剂量组和EAW低、高剂量组小鼠分别予EAT和EAW各2.0、8.0 g/kg(含生药量)灌胃, 健康对照组和模型组小鼠均给予等体积纯净水灌胃, 1次/d, 直至开始造模后第30天, 共灌胃33次。EAT低、高剂量组和EAW低、高剂量组, 以及模型组小鼠均予5%四氯化碳橄榄油溶液8 mL/kg腹腔注射, 健康对照组小鼠予等体积0.9%氯化钠溶液腹腔注射, 每周注射2次, 至开始造模后第30天, 共注射9次。检测各组小鼠的肝脏指数和血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素、白细胞介素-6(IL-6)水平。采用苏木精-伊红和Masson染色法观察小鼠肝组织病理学变化并计算胶原容积分数, 采用改良组织学炎症活动度(HAI)和Ishak系统评分评估小鼠肝组织的肝脏炎症反应和纤维化程度。采用免疫组织化学染色法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平, 蛋白质印迹法检测α-SMA、基质金属蛋白酶2(MMP2)和胞外信号调节激酶(ERK)1/2的蛋白质表达水平, 荧光定量聚合酶链反应检测MMP2、ERK1/2的mRNA表达水平。统计学方法采用方差分析、Tukey检验、Dunn检验。结果 EAW低、高剂量组和EAT高剂量组小鼠的肝脏指数均低于模型组(0.06±0.01、0.05±0.01、0.05±0.01比0.07±0.01), 差异均有统计学意义(q=5.12、7.70、7.11, 均P<0.01)。EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组小鼠血清ALT、AST水平均低于模型组[(601.76±141.38)、(283.35±42.32)、(734.74±116.06)、(391.60±34.33) U/L比(982.45±96.04) U/L, (509.49±152.29)、(345.41±67.39)、(282.30±65.72)、(243.23±45.20) U/L比(766.01±114.49) U/L], 差异均有统计学意义(qALT =9.88、20.81、7.65、17.58, qAST =5.11、12.52、14.92、15.56;均P<0.001)。EAW和EAT高剂量组小鼠血清总胆红素水平低于模型组[(6.81±0.49)、(7.08±1.78) μmol/L比(12.68±3.28) μmol/L], 差异均有统计学意义(q=6.31、6.01, 均P<0.01)。EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组小鼠血清IL-6水平均低于模型组[(29.26±5.42)、(24.28±4.75)、(9.05±1.74)、(8.01±1.24) ng/L比(53.21±10.05) ng/L], EAT低剂量组IL-6水平低于EAW低剂量组, EAT高剂量组IL-6水平低于EAW高剂量组, 差异均有统计学意义(q=12.20、14.73、22.48、22.11、10.28、7.96, 均P<0.001)。EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组胶原容积分数均低于模型组[(6.15±1.09)、(2.91±0.76)、(7.07±1.37)和(5.31±0.80)分比(12.36±1.96)分], EAW高剂量组低于EAW低剂量组和EAT低、高剂量组, 差异均有统计学意义(q=11.68、17.78、9.94、13.25, 6.10、7.84、4.53;均P<0.05)。EAW和EAT高剂量组的HAI和Ishak系统评分均低于模型组[6.0分(5.5分, 7.5分)、7.0分(6.0分, 7.5分)比13.0分(12.0分, 13.0分), 1.0分(1.0分, 2.0分)、2.0分(1.0分, 2.0分)比4.0分(3.0分, 4.0分)], 差异均有统计学意义(ZHAI=3.38、3.23, Zlshak=3.22、3.03;均P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示, EAW低剂量组、EAW高剂量组、EAT高剂量组、EAT低剂量组、模型组小鼠肝组织中α-SMA表达水平分别为4.76±0.36、2.75±0.29、3.72±0.34、5.20±0.79、5.98±0.52, 蛋白质印迹法检测结果显示, 模型组、EAW低剂量组、EAW高剂量组、EAT低剂量组、EAT高剂量组α-SMA蛋白质表达水平分别为0.96±0.11、0.67±0.07、0.22±0.01、0.78±0.08、0.68±0.07, 2种检测方法均提示EAW低、高剂量组和EAT高剂量组小鼠肝组织中α-SMA表达水平均低于模型组, EAW高剂量组的α-SMA表达水平均低于EAW低剂量组和EAT低、高剂量组, 差异均有统计学意义(q免疫组织化学=6.06、15.95、11.18、9.92、12.10、4.79, q蛋白质印迹法=7.29、18.34、6.84、11.05、13.97、11.49, 均P<0.05)。EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组, 以及模型组小鼠肝组织中MMP2、ERK1/2的蛋白质和mRNA表达水平分别为0.18±0.04、0.16±0.04、0.28±0.02、0.21±0.02、0.84±0.02, 0.80±0.02、0.57±0.08、0.83±0.03、0.69±0.02、0.91±0.04, 18.74±1.90、10.73±1.24、24.99±1.84、7.19±0.48、24.68±1.18, 29.44±4.47、11.96±0.53、24.75±4.04、5.30±0.36、35.76±0.85, EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组小鼠肝组织中MMP2蛋白质表达水平均低于模型组, EAW、EAT高剂量组小鼠肝组织中ERK1/2蛋白质表达水平均低于模型组, EAW高剂量组ERK1/2蛋白质表达水平低于EAT高剂量组, EAW、EAT高剂量组小鼠肝组织中MMP2和ERK1/2的mRNA表达水平均低于模型组, EAW高剂量组的MMP2和ERK1/2 mRNA表达水平均低于EAW低剂量组, EAT高剂量组MMP2和ERK1/2 mRNA表达水平均低于EAT低剂量、EAW高剂量组, 差异均有统计学意义(q=22.15、22.96、18.87、21.31, 13.42、8.53, 4.90, 18.57、23.29、16.49、21.11, 10.66、12.12, 23.70、15.38、13.48、16.73, 均P<0.05)。结论 EAT和EAW均可减轻四氯化碳诱导的小鼠肝损伤和肝纤维化, 可能与抑制ERK1/2、IL-6等表达而影响Ras/ERK-MMP2信号通路有关。
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