人类白细胞抗原-G5过表达慢病毒载体的构建以及JAR-HLA-G5稳转细胞株的建立

作者：曹维维; 袁成良^*

来源：中国临床药理学杂志, 2021, 37(18): 2495-2498.

DOI：10.13699/j.cnki.1001-6821.2021.18.028

• 人类白细胞抗原G5
• 慢病毒载体
• 人绒毛膜癌细胞
• 类风湿关节炎

目的构建过表达人类白细胞抗原G5(HLA-G5)慢病毒载体,筛选建立稳定表达HLA-G5的JAR稳转细胞株。方法根据HLA-G5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片段。将目的基因定向接入经BamHI/AgeI酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒GV492-HLA-G5。筛选阳性克隆和测序鉴定后,使用三质粒包装系统将含有目的基因的重组质粒GV492-HLA-G5和辅助包装质粒共转染至293T细胞进行病毒包装及纯化并测定病毒滴度。设置过表达实验(OE)组和阴性对照(NC)组,在感染复数为20的条件下感染JAR细胞。用荧光显微镜观察各组绿色荧光蛋白的表达情况。用浓度为2μg·mL-1嘌呤霉素筛选出稳定表达HLA-G5的JAR细胞株。用qRT-PCR和Western blot法检测JAR细胞中HLA-G5的mRNA和蛋白表达水平。结果经PCR及测序鉴定证明,序列与设计序列一致,成功构建重组慢病毒载体。病毒滴度结果显示,OE组的滴度为2×108TU·mL-1,NC组的滴度为4×108TU·mL-1。qRT-PCR显示OE组JAR细胞中HLA-G5的mRNA(108.69±4.25)表达水平较NC组(1.00±0.76)明显增高(P<0.01)。Western blot显示OE组JAR细胞中HLA-G5的蛋白(65.84±14.11)表达水平较NC组(1.35±0.37)明显升高(P<0.01)。结论成功构建HLA-G5慢病毒载体并筛选建立JAR-HLA-G5稳转细胞株。

• 单位
  德阳市人民医院; 成都中医药大学