十二指肠钩虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的分离、表达与活性研究

作者：邵正; 邓莉; 崔咏诗; 卢晓湧; 张菊英; 卢玲玲; 许琴英; 陈传; 何庆丰; 彭礼飞^*

来源：中国病原生物学杂志, 2022, 17(11): 1278-1282.

DOI：10.13350/j.cjpb.221108

• 十二指肠钩虫
• 半胱氨酸蛋白酶抑制剂
• 原核表达
• 组织蛋白酶

目的 分离、克隆十二指肠钩虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂AduCPI1-AduCPI4基因，在大肠埃希菌中进行表达，了解重组AduCPI1-AduCPI4对组织蛋白酶(cathepsin, cat)的抑制作用。方法 根据预测的4种编码AduCPI基因序列(GenBank No JQ762416-JQ762419)设计引物，采用PCR技术从十二指肠钩虫成虫cDNA中扩增AduCPIs成熟蛋白编码基因，并克隆、连接到表达质粒pET32a-sumo,构建重组原核表达载体。重组载体转入到E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化破碎菌上清中的重组融合蛋白，在纯化柱上用SUMO蛋白酶酶切融合伴侣，收集穿透液获得纯化的重组目的蛋白，采用SDS-PAGE分析蛋白表达及纯化情况，采用酶活性抑制试验检测4种重组AduCPI对catB、catL和catS的抑制作用。结果 扩增并克隆获得了4种AduCPI的成熟蛋白编码基因，构建的重组表达载体转化大肠埃希菌后表达相应蛋白，经纯化获得重组AduCPI1-AduCPI4。4种AduCPI抑制catS(0.5 nmol/L)(pH 6.5或7.4)的IC50在(0.60±1.13)nmol/L～(2.89±1.37)nmol/L,抑制catL(0.5 nmol/L)(pH 5.5)的IC50在(0.50±1.06)nmol/L～(1.42±1.07)nmol/L,抑制catB(0.5 nmol/L)(pH 6.0或7.4)的IC50在(5.24±1.03)nmol/L～(68.90±1.38)nmol/L,其中以AduCPI4对3种组织蛋白酶的抑制作用最强，而AduCPI2对catS、catB(pH7.4)的IC50分别为(0.80±1.08)nmol/L和(68.90±1.38)nmol/L,抑制作用效率差异较大，AduCPI2对catS具有较好的选择性抑制作用。结论 克隆表达了4种AduCPI,该4种蛋白对组织蛋白酶L和S均具有很强的抑制作用，对组织蛋白酶B的抑制作用也较强，研究结果为进一步了解AduCPIs的生物学功能及其应用奠定了基础。

• 单位
  广东医科大学