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摘要
目的探讨MAPK家族中P38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)信号通路在百草枯(Paraquat, PQ)诱导的肺泡上皮细胞上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)中的作用。方法在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)中加入不同浓度PQ(0、25、50、100μmol/L)后共培养6、12、24 h。倒置相差显微镜观察细胞形态学改变,划痕实验评估细胞迁移能力,免疫印迹法(Western blot)检测上皮及间质细胞表型蛋白表达(上皮细胞表型蛋白:E-cad、ZO-1,间质细胞表型蛋白:Vimentin、a-SMA)、MAPK信号通路关键蛋白的表达(P-p38 MAPK、P-Erk1/2、P-JNK),实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测成纤维细胞/肌成纤维细胞(MFB/FB)主要产物COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、Fn和EMT来源的成纤维细胞标志物FSP-1的基因表达。结果 100μmol/L PQ分别处理6、12、24 h,细胞由卵圆形或多边形的上皮细胞变成长梭形的间质细胞,细胞间连接消失,且时间越长形态学改变越明显。与对照组比较,50、100、200、300μmol/L PQ处理24 h的细胞存活率明显下降,200μmol/L PQ作用于细胞的时间越长(6、12、24、36、48 h),细胞存活率越低;与对照组比较,50、100μmol/L PQ诱导上皮细胞标记蛋白E-cad、ZO-1蛋白表达下调,且下调的趋势随时间延长更加明显,差异有统计学意义(P<0.05);同时,随着PQ诱导剂量的升高、时间的延长,间质细胞标记蛋白α-SMA、vimentin蛋白表达逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示,与对照组比较,100μmol/L PQ处理24h后的细胞迁移能力明显增强,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,100μmol/L PQ诱导细胞24 h后,P-p38MAPK、P-JNK及P-Erk1/2蛋白表达显著上调,差异有统计学意义(P<0.05),分别给予上述蛋白的抑制剂进行干预后,蛋白磷酸化水平较诱导组均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果显示,与对照组比较,PQ促进了Fn、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、FSP-1 mRNA表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PQ诱导肺泡上皮细胞通过EMT转变为间质细胞,可能为MFB的一个重要来源;MAPK家族中p38 MAPK、ERK、JNK信号通路参与了PQ诱导EMT的发生。
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