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摘要
以腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)基因组DNA为模版,通过PCR克隆编码解旋酶Tte-uvrD的基因tte-uvrd,将该基因插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体pET-32a(+)-tte-uvrd,转入E.coli BL21中,经蓝白斑筛选和双酶切法筛选阳性重组转化子,挑取测序正确的单个阳性菌落,在IPTG诱导下表达出重组蛋白Tte-uvrD。诱导后的菌体经超声破碎和离心,上清液用硫酸铵沉淀法初步纯化,透析除盐,冻干复溶后得到粗酶液。用tHDA反应来验证Tte-uvrD粗酶液的活性,比较不同储存温度下粗酶液酶活保持的时间,并比较-20℃下储存两个月的粗酶液与商品化纯酶的tHDA反应灵敏度。结果表明,用本研究建立的克隆方法可成功克隆出耐热解旋酶TteuvrD,其粗酶液能用于tHDA反应,说明粗酶液具有解旋活性;粗酶液在-20℃下第80d酶活仍能保持稳定,4℃下则只能保持酶活约一周;-20℃下储存两个月的粗酶液能达到与商品化纯酶相当的灵敏度。
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