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摘要
目的：采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）人源化抗体基因以不同轻链拷贝数定点整合至抗凋亡CHO-K1bak-/bax-(CHO-Ie3)细胞的LOC103162981基因内NW＿003626341.1位点处，比较轻链拷贝数对抗体表达的影响。方法：将编码EGFR抗体轻、重链基因，绿色荧光蛋白基因，嘌呤霉素抗性基因的供体质粒pEF1α-LH、pEF1α-LLH，分别与单导向RNA(sgRNA)、Cas9质粒用转染试剂盒共转染进CHO-Ie3细胞，经药筛及流式分选后在96孔板中获得单克隆细胞株。将这些细胞的培养上清进行Dlot-blotting、Western blotting实验，提基因组后PCR扩增鉴定外源蛋白是否准确整合至目标位点并表达。悬浮驯化成功整合外源基因的细胞株，批次培养分析EGFR抗体的表达情况。结果：获得1株CHO-Ie3-LH细胞，阳性单克隆率约为1.89%,2株CHO-Ie3-LLH细胞，阳性单克隆率约为3.51%，其中轻链双拷贝的细胞株所表达外源蛋白的产量达115.40 mg/L，相较于轻链单拷贝的细胞株表达量提升35.32%.结论：在CHO-Ie3细胞中采用CRISPR/Cas9定点整合技术可以成功表达EGFR抗体，且抗体轻链的拷贝数的增加对蛋白表达起到一定的提高作用。
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