科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的 探究肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)通过调控内质网钙稳态蛋白（CHERP）影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法衣霉素（TM）处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素（Rapa）处理C28/I2（分为：NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组），Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）和对照小鼠（Control）软骨组织分离原代软骨细胞，qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA水平，Western blot检测IRE1α/p-IRE1α、CHERP表达水平，流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)处理原代软骨细胞（分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1组），Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流（分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组）。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α，免疫荧光检测自噬水平。结果 TM处理C28/I2细胞后，内质网应激相关标志蛋白表达上调，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）,p62表达下调（P<0.05）。相较对照组，Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（P<0.001）,4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.05）。相较于对照组，原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后，ERN1(P<0.01)、ATG5(P<0.001)、ATG7(P<0.001)m RNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调（P<0.01）,CHERP蛋白表达上调（P<0.05），胞内钙离子含量显著上升（P<0.001）。巴佛洛霉素A1处理原代软骨细胞后，Control+Bafilomycin A1组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.01）,ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（P<0.05）。自噬双荧光病毒处理后，ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强（P<0.05）。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度，过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论 IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白，升高胞内钙离子含量，进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。
-
单位重庆医科大学; 基础医学院; 首都医科大学附属北京友谊医院
