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摘要
Rag GTPase属于Ras家族成员的GTP结合蛋白，定位于溶酶体。果蝇RagA蛋白是哺乳动物RagA/RagB蛋白同源物，在果蝇中RagA与RagC结合，共同调节TORC1活性。本实验室发现敲减RagA使果蝇发育停滞在蛹期。为了探究具体原因，基于密码子的简并性，通过融合PCR、同源重组克隆的方法构建了改变RagA RNA干扰靶标位点的过表达载体pUASp-RagAwt；在此基础上，通过点突变的方式构建了与GTP结合的RagA过表达载体pUASp-RagA-Q61L和与GDP结合的RagA过表达载体pUASp-RagA-T16N。通过显微注射和遗传杂交等方式分别筛选出pUASp-RagA-wt、pUASp-RagA-Q61L、pUASp-RagA-T16N转基因果蝇。通过体细胞克隆的方法检测了不同活性状态的RagA对TORC1活性的影响，RagA调节TORC1活性：与GTP结合处于激活态；与GDP结合处于失活态。为确定GTP/GDP状态下RagA活性对果蝇发育的影响，将UASp转基因系果蝇与Tub-Gal4/TM6果蝇杂交并统计后代羽化率，判断由GTP/GDP状态控制的RagA活性对果蝇生长发育的影响。结果发现，RagA敲减果蝇由于蛹期阶段内出现障碍不能发育为成虫。在RagA敲减的背景下，过表达野生型RagA能够完全挽救RagA敲减所导致的果蝇致死。过表达GTP结合型的RagA-Q61L能够部分挽救RagA敲减的致死效应，过表达GDP结合型的RagA-T16N不能挽救RagA敲减的致死效应。表明RagA在果蝇生长发育过程中起着重要的作用，且RagA与GTP/GDP结合需保持动态平衡。RagA仅与GTP或GDP结合会使TORC1活性处于过高或过低的状态，影响果蝇的生长发育。
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