斑马鱼notch3基因真核表达载体的构建及其表达分析

作者：吴坤坤; 徐行; 季策; 任建峰; 李伟明; 张庆华^*

来源：生物技术通报, 2022, 38(01): 179-186.

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0289

• 斑马鱼
• notch3
• N3ICD
• 免疫荧光
• 真核表达载体
• NF-κB

为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能，构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达。其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence，CDS)从NCBI的在线数据库中获得，根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain，NICD)，接着利用同源重组技术构建pCMV-N3ICD表达载体。再通过双酶切和测序筛选阳性重组载体，借由脂质体法转染至HEK293T细胞中，最后经细胞免疫荧光技术和蛋白质印迹法验证N3ICD的表达。结果显示，重组质粒经酶切电泳片段及测序比对均与预期结果一致。在蛋白质印迹实验中N3ICD蛋白可正常表达，且大小与预测结果一致。细胞免疫荧光显示重组质粒可以在HEK293T细胞的细胞核中表达。同时，构建的N3ICD真核表达载体能够明显增强NF-κB(nuclear factor-кB)家族中rela和nfκb1启动子的活性。成功构建了pCMV-N3ICD真核表达载体。

• 单位
  国家水生动物病原库; 上海海洋大学