科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的 为解析鼠伤寒沙门菌YfbU的功能，原核表达并纯化YfbU蛋白，培养优化蛋白质晶体，通过同步辐射X射线散射法收集衍射数据，为该蛋白的结构解析和功能实验奠定基础。方法 以YfbU蛋白生物信息学预测为基础，使用PCR方法扩增沙门菌基因组中的yfbu基因，再与原核表达载体PGL01连接，构建yfbu-PGL01重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21感受态中，经阳性筛选且测序正确后，通过IPTG诱导目标蛋白的表达。经破碎离心粗提YfbU蛋白，然后依次用镍离子亲和柱、阴离子交换柱、凝胶过滤层析柱3种方法进行纯化。纯化蛋白先用坐滴板初筛晶体，再用悬滴板优化晶体。获得的单晶、个大、形状规则的晶体送上海同步辐射光源收集衍射数据。结果 成功构建了yfbu-PGL01表达菌株，经IPTG诱导表达并纯化获得了高纯度，性状稳定的可溶性YfbU蛋白，蛋白浓度达8.8 mg/ml,蛋白纯度>95%。YfbU蛋白在1.0 mol/L Ammonium citrate dibasic, 0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate, pH4.6条件下优化出单晶结构、形状规则的晶体。通过上海同步辐射光源的衍射确定为蛋白质晶体，分辨率达到4.2?。结论 鼠伤寒沙门菌YfbU蛋白在大肠埃希菌BL21中稳定表达，可溶性好。纯化蛋白经阴离子交换柱和凝胶过滤层析，洗脱液中的蛋白均呈峰型对称的单峰，峰值UV>2000mAU,且纯度较高，可用于蛋白质晶体的筛选。YfbU晶体衍射数据的搜集为进一步解析蛋白结构、筛选YfbU蛋白的底物及预测蛋白功能等一系列研究奠定了基础。
- 单位
