Ghrelin对血管紧张素Ⅱ诱导的脐静脉内皮细胞氧化应激和内皮功能损伤的影响

作者：邓彬; 方立; 陈晓彬; 陈美芳; 谢秀梅

来源：中南大学学报(医学版), 2010, 35(10): 1037-1047.

DOI：10.3969/j.issn.1672-7347.2010.10.003

• 促生长激素释放肽
• 血管紧张素Ⅱ
• 活性氧
• 一氧化氮
• 磷脂酰肌醇3-激酶/丝-苏氨酸激酶
• 内皮型一氧化氮合酶

目的:探讨促生长激素释放肽(ghrelin)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, Ang Ⅱ)诱导的离体培养的脐静脉内皮细胞(human umbilicus vein endothelial cell-12,HUVEC-12)损伤的保护作用.方法:(1)在培养的人脐静脉内皮细胞中加入10-9~10-6mol/L AngⅡ共培养24 h,或用10-9~10-6mol/L ghrelin预处理2 h后与10-6mol/L AngⅡ共培养24 h.用MTT法测量内皮细胞活力和用AnnexinV-FITC凋亡试剂盒在流式细胞仪下测量内皮细胞凋亡率.(2)HUVEC用10-9,10-8,10-7,10-6mol/L AngⅡ分别培养3,6,12或24 h,10-9,10-8,10-7或10-6 mol/L ghrelin预处理2 h后与10-6mol/L AngⅡ共培养24 h.生长激素促分泌剂受体1a(growth hormone secretagogue receptor 1a,GHSR1a)受体阻断剂 [D-Lys3]GHRP-6加入 10-6 mol/L ghrelin预处理2 h后与10-6mol/L AngⅡ共培养24 h组,DCF荧光探针法测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS).(3)HUVEC分别与 10-9,10-8,10-7或10-6mol/L AngⅡ和 ghrelin共培养24 h,与10-6mol/L AngⅡ孵育3,6,12或24 h,或10-9,10-8,10-7或10-6mol/L ghrelin预处理30 min,1 h或2 h后与10-6mol/LAngⅡ培养24 h,加入丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路(mitogen-activated protein kinase /extracullar signal regulated kinase 1/2,MAPK/ERK1/2)信号通路抑制剂PD98058、磷脂酰肌醇3-激酶/丝-苏氨酸激酶(phosphoinositide-3-kinase/serine threonine kinase,PI3K/Akt )阻断剂 wortmannin和[D-Lys3]GHRP-6 共培养24 h,与用AngⅡ和ghrelin孵育的HUVEC 比较上清液中NO产量,HUVEC用ghrelin,PD98059, wortmannin, [D-Lys3]GHRP-6预处理2 h后与10-6mol/L AngⅡ共培养24 h,或用ghrelin加上PD98059,wortmannin及[D-Lys3]GHRP-6预处理2 h后与10-6mol/L AngⅡ共培养24 h.内皮细胞上清中的一氧化氮(nitric oxide, NO)用Griess法测量.(4)HUVEC用空白对照或AngⅡ在有或没有用ghrelin或ghrelin和wortmannin 一起预处理的情况下孵育,用免疫印迹法(Western blot )测量内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的蛋白表达及丝苏氨酸激酶(serine threonine kinase,Akt)磷酸化蛋白表达.结果:AngⅡ引起内皮细胞损伤,增加HUVEC细胞凋亡率,减少培养的HUVEC细胞上清中NO含量,而ghrelin保护HUVEC免受AngⅡ损伤;Ghrelin减少与AngⅡ共同孵育的HUVEC ROS的产生.这种作用被[D-Lys3]GHRP-6消除.PD98059能阻止AngⅡ导致的HUVEC分泌NO减少,Wortmannin和[D-Lys3]GHRP-6消除Ghrelin保护HUVEC释放NO的作用;AngⅡ减少eNOS 的表达,但ghrelin能增加eNOS表达,Wortmannin消除Ghrelin的这种作用;Ghrelin 能刺激p-Akt的表达并在10~20 min达到高峰.结论:Ghrelin在AngⅡ导致的HUVEC损伤中起保护作用,其机制与通过GHSR1a受体减少氧化应激、增加eNOS蛋白表达和激活PI3K/Akt信号通路有关.

• 单位
  中南大学湘雅医院