单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究

作者：曾成容; 刘馨; 张晨旭; 毕文文; 梅世慧; 何广霞; 张峻杰; 文明^*; 周碧君^*; 陈江凤; 姜海波

来源：中国预防兽医学报, 2023, 45(09): 895-904.

• 嗜水气单胞菌
• 单宁酸
• 转录组

嗜水气单胞菌作为水产养殖业中的主要病原菌，严重危害该产业的发展。为探究单宁酸对嗜水气单胞菌的抑菌作用及其转录组的影响，本实验将单宁酸2倍倍比稀释(8μg/mL～8 192μg/mL)后，测定单宁酸对嗜水气单胞菌ATCC 7966株的最小抑菌浓度(MIC)；将嗜水气单胞菌分别与不同浓度的单宁酸共培养，根据所测细菌OD600nm值(共测24 h)，绘制细菌的生长曲线。结果显示，单宁酸对嗜水气单胞菌的MIC为2 048μg/mL；浓度低于64μg/mL (临界值)单宁酸处理后不影响嗜水气单胞菌的生长。因此本实验采用64μg/mL的单宁酸与嗜水气单胞菌ATCC 7966株共培养，每组重复4次，12 h后提取各组嗜水气单胞菌总RNA，反转录为cDNA后构建cDNA文库，再利用随机引物，经PCR扩增、定量后，采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。通过计算每个样品中r RNA的占比(rRNA%)及碱基的错误率对测序数据质控；采用Bowtie2将获得的各组嗜水气单胞菌测序数据与GenBank中嗜水气单胞菌ATCC 7966株参考基因组比对，分析它们之间的相似性。结果显示，各组测序样品的r RNA%和碱基错误率均分别低于0.8%和0.024%，且与参考基因组的相似性均大于99%，表明测序数据可靠，可以用于后续分析。采用edgeR、DESeq2和DESeq软件筛选并分析各组嗜水气单胞菌转录水平差异及显著差异的基因，采用Goatools和KOBAS软件对转录水平显著差异基因进行GO功能注释与KEGG信号通路的富集分析，利用RT-q PCR对转录水平显著上调和显著下调的各4个基因验证。结果显示：与对照组相比，单宁酸处理组嗜水气单胞菌中转录水平显著上调的基因144个，显著下调的基因104个，转录水平显著变化的基因主要集中在嗜水气单胞菌的VI型分泌系统(T6SS)、铁调控和Ton B系统、ABC转运蛋白系统相关蛋白的编码基因。GO功能注释结果显示，单宁酸处理嗜水气单胞菌后共显著富集到88个GO term,38个生物学过程(BP)、10个细胞组分(CC)、40个分子功能(MF)，主要涉及蛋白质折叠、亮氨酸生物合成和代谢、铁载体生物合成和代谢、铁硫簇结合、金属簇结合、铁载体跨膜转运活性等。KEGG富集分析结果显示，单宁酸处理嗜水气单胞菌后的转录显著差异基因富集到5条信号通路，包括铁载体蛋白生物合成、硫胺素代谢、C5-支链二元酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成及脂质与动脉粥样硬化等。RT-q PCR验证结果显示，RNA-Seq与RT-q PCR结果基本一致。本研究首次分析了单宁酸处理嗜水气单胞菌后的转录组数据的变化，证实单宁酸主要影响嗜水气单胞菌支链氨基酸、铁载体及硫胺素的生物合成和代谢等信号通路，从而影响该菌的生理生化功能甚至毒力。本研究为全面探究单宁酸在防治嗜水气单胞菌感染中的作用及作用机制奠定了实验基础，同时也为探寻嗜水气单胞菌抗生素的替代品提供新思路。

• 单位
  贵州大学; 动物科学学院