基于CaCC的P2ry2调节剂细胞筛选模型的建立及应用

作者：郭佳琦; 肖云萍; 丁旭; 解宇浩; 张嘉琪; 郝峰^*

来源：中国病理生理杂志, 2020, 36(11): 2105-2112.

• P2Y2嘌呤受体
• 钙激活氯离子通道
• 高通量筛选
• FRT细胞

目的:构建基于钙激活氯离子通道(CaCC)的高通量P2Y2嘌呤受体(P2ry2)调节剂细胞筛选模型。方法:采用RT-PCR方法验证Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮细胞(FRT细胞)中P2ry2的mRNA表达水平,切胶回收PCR扩增产物并进行序列测序和比对,进一步应用Western blot检测FRT细胞的P2ry2蛋白表达水平。构建钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L真核表达载体,应用脂质体转染、抗生素筛选和有限稀释,获取共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。采用倒置荧光显微镜观察共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L细胞的情况,并应用荧光淬灭动力学实验验证模型的有效性;荧光淬灭动力学实验验证细胞模型是否可筛选P2ry2调节剂,并应用Fura-2/AM荧光探针法检测细胞内游离钙的变化,探究胞内Ca2+浓度与P2ry2调节剂的剂量依赖关系;用Z′因子评价本模型的稳定性和可重复性。结果:FRT细胞内源性表达P2ry2;倒置荧光显微镜中观察到ANO1在细胞膜上表达绿色荧光,YFP-H148Q/I152L在胞浆中表达绿色荧光,成功构建了共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的细胞模型;荧光淬灭动力学实验证实该细胞模型可筛选P2ry2调节剂,应用Fura-2表明该细胞模型可敏感地检测胞浆内钙离子浓度的变化且Ca2+浓度与P2ry2调节剂及相对荧光强度呈剂量依赖关系;Z′因子为0.75,说明该细胞模型可以高通量筛选P2ry2的调节剂且有良好的稳定性与可重复性。结论:成功构建了一种经济简便快捷高效的P2ry2调节剂细胞筛选模型,适用于P2ry2调节剂的发现与评价。

• 单位
  北华大学; 吉林医药学院