KDM5C基因shRNA重组慢病毒载体的构建及其对肝癌HepG2细胞的增殖和迁移的影响

作者：胡敏敏; 詹浩炼; 刘丽璇; 项梦琦; 蒲泽锦; 李国平; 吴灵飞

来源：世界华人消化杂志, 2017, 25(08): 691-701.

• HepG2细胞
• Lv-shKDM5C
• GAS5
• 细胞增殖
• 细胞迁移

目的制备干扰KDM5C基因重组慢病毒载体,观察干扰人KDM5C基因后对肝癌Hep G2细胞增殖、迁移及长链非编码RNA GAS5表达的影响.方法设计3对针对KDM5C基因短发夹型RNA干扰序列（short hairpin RNA,sh RNA）和1对阴性对照序列,退火后连接到p LKD载体上,经转化PCR阳性克隆筛选及测序鉴定.使用四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒,慢病毒包装后用孔稀释法进行滴度测定.将慢病毒感染Hep G2细胞,q RT-PCR和Western blotting检测Hep G2细胞KDM5C的m RNA和蛋白表达.MTT法及细胞划痕实验检测转染Lv-sh KDM5C后细胞增殖及迁移能力,同时观察lnc RNA GAS5 m RNA的表达水平变化.结果P C R扩增和测序结果证明,成功构建L vsh KDM5C慢病毒载体.经包装产生的3组慢病毒载体滴度:Lv-sh KDM5C-1是4.95×108TU/m L,Lv-sh KDM5C-2是3.46×108 TU/m L,L v-s h K D M5C-3是3.08×108 T U/m L.与正常肝细胞相比,肝癌Hep G2细胞KDM5C表达明显增加.与未转染组及阴性对照组相比,3组Lv-sh KDM5C病毒感染Hep G2细胞后KDM5C的m RNA及蛋白表达量均显著下降（P<0.05）;其中Lv-sh KDM5C-3组下降最为明显（P<0.05）,因此选取Lv-sh KDM5C-3进行后续实验.MTT结果显示Lv-sh KDM5C-3转染肝癌Hep G2细胞后48 h和72 h细胞生长增殖均受到抑制（P<0.05）.细胞划痕实验结果显示Lv-sh KDM5C-3中细胞迁移率明显低于阴性对照组（P<0.05）.q RT-PCR结果表明干扰KDM5C后lnc RNA GAS5 m RNA表达显著升高（P<0.05）.结论本研究成功构建了特异性沉默人KDM5C基因的sh RNA慢病毒载体.将其转染肝癌Hep G2后可有效抑制细胞增殖和迁移.我们首次发现干扰KDM5C还可增加长链非编码RNA GAS5的表达.

• 单位
  汕头大学医学院第二附属医院