检测大肠杆菌内c-di-GMP水平的双荧光素报告质粒的构建及应用

作者：张贝贝; 胡剑刚; 王欣宇; 郭伟奇; 姚澜; 王芷洋; 王帝; 祁晶晶; 田明星; 鲍衍清; 王少辉^*

来源：微生物学报, 2023, 63(12): 4814-4822.

DOI：10.13343/j.cnki.wsxb.20230313

• 环二鸟苷酸
• 核糖开关
• 双荧光素报告质粒
• 检测

细菌通过调控第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanylate, c-di-GMP)而促进其适应环境、存活及致病。【目的】本研究旨在建立有效的c-di-GMP水平检测方法，为大肠杆菌内c-di-GMP水平检测提供便利条件。【方法】根据c-di-GMP核糖开关受体的调控方式、荧光报告基因等设计引物，通过重叠聚合酶链反应(overlap polymerase chain reaction, overlap PCR)和同源重组酶构成基于核糖开关的双荧光素报告质粒pAmCherry-Vc2EGFP(pACVcE)，然后构建c-di-GMP代谢基因过表达菌株和缺失菌株，利用pACVcE检测大肠杆菌内c-di-GMP水平。【结果】OverlapPCR扩增产物与目的靶序列一致，测序结果证明pACVcE序列正确。表达c-di-GMP合成酶DgcZ的大肠杆菌胞内c-di-GMP水平显著升高，而表达c-di-GMP降解酶PdeK的大肠杆菌胞内c-di-GMP水平显著降低。禽致病性大肠杆菌的胞内c-di-GMP水平检测发现c-di-GMP降解酶基因pdeK缺失后胞内的c-di-GMP水平显著升高。【结论】本研究构建了基于核糖开关的双荧光素报告质粒，可方便、快速检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平。

• 单位
  中国农业科学院上海兽医研究所