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摘要
【目的】克隆表达和纯化火球菌Pyrococcus furious来源的瓣状核酸内切酶1基因pFEN1(PF1414),对该蛋白的活性和酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将pFEN1在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的荧光标记的寡核苷酸片段作为底物,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定pFEN1在体外的酶学特性以及与其他蛋白的相互作用。【结果】pFEN1重组蛋白能在大肠杆菌中进行高效表达;高于100 mmol/L的NaCl会抑制pFEN1的活性;pFEN1的核酸酶活性依赖于金属离子Mg2+或Mn2+,且Mn2+的催化效率优于Mg2+;来自嗜热古菌的pFEN1是一种耐高温蛋白,最适反应温度为60–65°C;增殖细胞核抗原(PCNA)能促进pFEN1的内切酶活性。【结论】本研究证实pFEN1是一种Mg2+或Mn2+依赖的核酸内切酶,且PCNA能促进该酶的活性。
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单位生命科学技术学院; 上海交通大学; 微生物代谢国家重点实验室
