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摘要
目的了解瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中铁含量及转铁蛋白受体1(TfR1)表达水平, 在体外构建Erastin诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)铁死亡模型, 检测Erastin和铁抑制素-1(Fer-1)对细胞活力、亚铁离子(Fe2+)含量及脂质过氧化物、铁死亡和纤维化相关调节因子的影响。方法收集2022年3至6月新疆医科大学第一附属医院6例瘢痕疙瘩组织与6例包皮组织, 采用组织铁含量试剂盒测定2种组织真皮层中铁含量, Western blotting法检测2种组织中TfR1蛋白表达情况。采用组织块培养法获取原代KFB和正常皮肤成纤维细胞(NFB), 使用Erastin诱导KFB铁死亡模型并用CCK-8法检测不同浓度的Erastin和Fer-1对细胞活性的影响, 筛选合适的药物浓度。后续实验分为5组:NFB组、control组、Erastin(0.6 μmol/L)组、Fer-1(1 μmol/L)组、Erastin(0.6 μmol/L)+Fer-1(1 μmol/L)组, 其中后4组采用KFB作为实验对象;采用划痕实验检测细胞迁移能力, 荧光探针法和试剂盒检测各组细胞中丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)和Fe2+含量;Western blotting法检测各组细胞中TfR1、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-1)表达水平, 免疫荧光检测KFB中TfR1、Gpx4蛋白表达及定位情况。采用GraphPad Prism 9.0统计软件, 计量资料以±s表示, 2组间比较采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果与正常皮肤组织比较, 瘢痕疙瘩中的铁含量及TfR1蛋白表达均明显较高(P<0.01)。不同浓度Erastin处理的KFB增殖率逐渐下降, IC50为0.61 μmol/L, Fer-1在0.1～20 μmol/L对KFB无明显毒性。划痕实验显示, control组迁移率显著高于NFB组(P<0.01);与control组相比, Erastin干预后KFB迁移率明显下降(P<0.01);与Erastin组相比, Erastin+Fer-1组KFB迁移明显加快(P<0.01)。control组ROS、MDA水平显著高于NFB组(P<0.01);与control组相比, Erastin组ROS、MDA水平及Fe2+含量显著升高(P<0.01), 而Fer-1组ROS、MDA水平和Fe2+含量显著降低(P<0.05);与Erastin组相比, Erastin+Fer-1组MDA、ROS水平及Fe2+含量均显著降低(P<0.01)。Western blotting显示, 与NFB组相比, control组铁死亡指标SLC7A11、GPx4蛋白表达明显减少(P<0.01), TfR1蛋白表达增加(P<0.01), 纤维化指标α-SMA、COL-1蛋白表达显著增加(P<0.01);与control组相比, Erastin组SLC7A11表达减少(P<0.01), TfR1、COL-1表达增加(P<0.01), 而Fer-1组SLC7A11、GPx4表达增加(P<0.01), TfR1、α-SMA、COL-1表达显著减少(P<0.01);与Erastin组相比, Erastin+Fer-1组GPx4、SLC7A11表达增加(P<0.01), TfR1、α-SMA、COL-1表达显著减少(P<0.01), 提示Fer-1能够逆转Erastin诱导的KFB铁死亡和促纤维化作用。免疫荧光显示, GPx4在细胞核及细胞质中均有表达, 与control组相比, Fer-1增加了KFB中GPx4的荧光强度(P<0.01);与Erastin组相比, Erastin+Fer-1组中GPx4的荧光强度显著增加(P<0.01);TfR1主要在细胞质中表达, 与control组相比, Erastin增加了KFB中TfR1的荧光强度(P<0.05), 而Fer-1组中TfR1荧光强度显著降低(P<0.01);与Erastin组相比, Erastin+Fer-1组TfR1荧光强度显著降低(P<0.01)。结论瘢痕疙瘩中铁过载且游离铁增多, Erastin可诱导KFB铁死亡并加重瘢痕疙瘩纤维化, Fer-1可逆转Erastin诱导形成的氧化损伤及铁蓄积, 有效抑制KFB发生铁死亡和瘢痕疙瘩纤维化。
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单位新疆医科大学第一附属医院
