猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

作者：张天爱; 李婷婷; 陶晓莉; 李藤菲; 林家锋; 胡思漫; 刘文秀; 佟伟; 李永刚^*

来源：中国畜牧兽医, 2022, 49(11): 4383-4391.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2022.11.029

• 猪流行性腹泻病毒(PEDV)
• S蛋白
• 蛋白纯化
• 原核表达
• 多克隆抗体

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S蛋白的结构和功能，为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】以PEDV经典CV777株为模板，通过PCR扩增获得S、S1基因片段；PCR扩增产物分别克隆pET-30a(+)原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体，构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白，通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测；将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体，获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验(IFA)检测特异性，通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价；将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞，以制备的多克隆抗体为一抗，经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】成功克隆出PEDV S和S1基因，构建了可表达PEDV-S重组蛋白的原核表达质粒和在HEK293T细胞中高效表达S1蛋白的真核表达质粒；PEDV-S重组蛋白在IPTG为0.5 mmol/L、16℃诱导8 h条件下可获得最高表达量，主要以包涵体形式存在；Western blotting结果显示，PEDV-S重组蛋白成功表达；ELISA检测结果显示，制备的多克隆抗体效价达1∶3 280 500;IFA结果显示，多克隆抗体有良好的特异性，可特异性识别PEDV-S和PEDV-S1蛋白。【结论】本研究获得了PEDV-S重组蛋白，并成功表达S1蛋白，制备出PEDV-S蛋白多克隆抗体，为研究S蛋白的结构和功能提供了条件，为揭示PEDV致病机制奠定了基础。

• 单位
  锦州医科大学; 基础医学院