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摘要
目的：构建N-myc下游调节基因1 (NDRG1)的shRNA干扰载体和过表达载体，转染人脑微血管内皮细胞（hCMECs）后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞。方法：将pGPU6-GFP质粒采用Bam HⅠ和BbsⅠ双酶切后，分别与设计的8条shRNA连接构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体，经测序鉴定后采用Lipofectamine 2000转染hCMECs，采用荧光显微镜观察载体转染效率，将PCR扩增的NDRG1编码区序列与pMD19-T连接，经测序正确后将重组质粒与pcDNA3.1空质粒采用限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ双酶切，连接后构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体，采用Lipofectamine 2000将测序正确的过表达载体转染hCMECs，采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测干扰和过表达的hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平，Western blotting法检测hCMECs中NDRG1蛋白表达水平，采用新霉素筛选出阳性克隆hCMECs。结果：pGPU6-GFP载体经双酶切后，电泳结果显示完全线性化，测序结果显示shRNA均成功连接至pGPU6-GFP载体；荧光显微镜观察载体转染效率约为70%;RT-qPCR法检测，有3个shRNA干扰载体的干扰效果良好，转染后hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平分别约为对照组的26%、21%和13%;Western blotting法检测到对应的特异性蛋白条带，重组质粒pcDNA3.1-NDRG1经双酶切后，电泳结果可见大小为1 185和5 428 bp的2条DNA条带，测序结果显示NDRG1基因成功插入，成功制备阳性克隆hCMECs。RT-qPCR法检测，阳性克隆hCMEC中NDRG1 mRNA表达水平较对照组升高，约为对照组的25.96倍；Western blotting法检测，hCMEC中NDRG1蛋白表达水平较对照组升高。结论：成功构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体并验证干扰效果；成功构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体和稳定过表达NDRG1的hCMECs。
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单位新疆农垦科学院; 动物科技学院; 石河子大学
