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摘要
目的开发基于PCR结合簇状规则间隔短回文重复序列及相关蛋白Cas12a (CRISPR/Cas12a快速检测华支睾吸虫囊蚴的方法。方法 使用内转录间隔区（ITS）引物以华支睾吸虫基因组DNA为模板进行PCR扩增，取PCR扩增产物、 Cas12a蛋白、 crRNA、单链DNA (ssDNA)报告分子和焦碳酸二乙酯水，选择其中1～5个试剂，分别制备5个CRISPR反应体系，在紫外光下观察反应结果，验证PCR?CRISPR/Cas12a检测系统的可行性。设计5个浓度梯度（100、 200、 300、 400、 500 nmol/L）优化ssDNA报告分子浓度；保持crRNA浓度为50 nmol/L，设计5个比例梯度（1.0∶1、 1.5∶1、 2.0∶1、 2.5∶1、 3.0∶1）优化Cas12a/crRNA比例，荧光定量PCR仪检测荧光信号。将重组质粒梯度稀释为10个不同浓度（10?2～107拷贝/μl）,PCR扩增、 CRISPR反应后检测荧光信号，评价检测系统的灵敏度。提取华支睾吸虫囊蚴、东方次睾吸虫囊蚴、猬迭宫绦虫裂头蚴、派氏异尖线虫和亚洲带绦虫节片基因组DNA, PCR扩增、 CRISPR反应后检测荧光信号，评价检测系统的特异性。压片镜检华支睾吸虫病流行区捕获的小型淡水鱼鱼肉，分别挑选出华支睾吸虫囊蚴、东方次睾吸虫囊蚴和其他囊蚴（未鉴定出虫种）等3种囊蚴混合感染，华支睾吸虫和东方次睾吸虫囊蚴的混合感染，华支睾吸虫和其他囊蚴的混合感染，东方次睾吸虫和其他囊蚴的混合感染，单华支睾吸虫囊蚴感染，单东方次睾吸虫囊蚴感染，单其他囊蚴感染和无囊蚴感染等8种鱼肉样品组织，提取DNA后进行PCR?CRISPR/Cas12a检测，在紫外光下观察反应结果。使用GraphPad prism 9.0软件对数据进行单因素方差分析，两两比较采用图基多重检验。结果完整的PCR?CRISPR/Cas12a检测系统能够在紫外光下产生荧光信号。ssDNA报告分子浓度为400 nmol/L时，反应体系的荧光值为（40 786±1 758） AU，高于300 nmol/L的（32 029±2 651） AU (P <0.05)，与500 nmol/L的（42 698±4 260） AU差异无统计学意义（P> 0.05），选取ssDNA报告分子浓度为400 nmol/L。Cas12a/crRNA比例为2.0∶1时，反应体系的荧光值为（48 950±3 723） AU，高于1.5∶1的（37 700±3 887） AU (P <0.05)，与2.5∶1的（55 630±3 110） AU差异无统计学意义（P> 0.05），选取Cas12a/crRNA比例为2.0∶1。灵敏度检测结果显示，重组质粒的浓度为10?1拷贝/μl时，反应体系的荧光值为（39 336±7 231） AU，与阴性对照的（2 216±743） AU差异有统计学意义（P <0.05）；当浓度降至10?2拷贝/μl时，荧光值为（5 451±1 957） AU，与阴性对照的差异无统计学意义（P> 0.05）。特异性检测结果显示，ITS引物能同时PCR扩增华支睾吸虫、东方次睾吸虫、猬迭宫绦虫、派氏异尖线虫和亚洲带绦虫等5种基因组DNA；相同扩增产物的CRISPR检测结果显示，仅以华支睾吸虫基因组DNA为模板的反应体系在紫外光下产生了荧光信号。PCR?CRISPR/Cas12a效果评价检测结果显示，8种不同囊蚴感染的鱼肉样品反应体系中，含有华支睾吸虫囊蚴的4管出现荧光信号。结论本研究建立了华支睾吸虫囊蚴的PCR?CRISPR/Cas12a检测方法，该方法灵敏度高、特异性好、高度模块化，具有较好的现场应用潜力。
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单位公共卫生学院; 江西省寄生虫病防治研究所; 南昌大学
