紫菀酮对体外破骨细胞分化和活性的影响及作用机制研究

作者：苏珮茹; 罗香雅; 余丽娜; 曾春平; 周琳^*

来源：中医正骨, 2023, 35(06): 24-35.

• 骨质疏松
• 破骨细胞
• 细胞分化
• 紫菀酮
• 体外研究技术
• 信号传导
• NF-κB
• 组织蛋白酶K
• 腺苷三磷酸酶
• 抗酒石酸酸性磷酸酶
• NFATC转录因子

目的:探讨紫菀酮对体外破骨细胞分化和活性的影响及作用机制。方法:(1)分析紫菀酮对核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮1μmol·L-1干预组、紫菀酮2.5μmol·L-1干预组、紫菀酮5μmol·L-1干预组和紫菀酮10μmol·L-1干预组，空白对照组加入完全培养基，阳性对照组加入含25 ng·mL-1RANKL的完全培养基，其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL-1RANKL的完全培养基，培养5 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色，统计各组破骨细胞数；(2)分析紫菀酮对Raw 264.7细胞活力的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、紫菀酮1μmol·L-1干预组、紫菀酮2.5μmol·L-1干预组、紫菀酮5μmol·L-1干预组和紫菀酮10μmol·L-1干预组，空白对照组加入完全培养基，其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮的完全培养基，分别培养48 h、120 h后测定各组细胞活力；(3)分析紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮5μmol·L-1干预组和紫菀酮10μmol·L-1干预组，空白对照组加入完全培养基，阳性对照组加入含25 ng·mL-1RANKL的完全培养基，紫菀酮5μmol·L-1干预组和紫菀酮10μmol·L-1干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL-1RANKL的完全培养基，培养5 d后采用鬼笔环肽和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，观察各组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成情况。(4)分析紫菀酮对核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)转录活性的影响。将稳定转染pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]载体的RAW 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组和紫菀酮10μmol·L-1干预组，空白对照组及阳性对照组加入完全培养基，紫菀酮10μmol·L-1干预组加入终浓度为10μmol·L-1紫菀酮的完全培养基；培养2 h后，阳性对照组及紫菀酮10μmol·L-1干预组分别加入RANKL溶液，使培养基中RANKL的终浓度为25 ng·mL-1;继续培养6 h后，检测各组细胞荧光素酶的荧光强度。(5)分析紫菀酮对核因子-κB抑制蛋白激酶α亚基(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit α,IκBα)蛋白表达的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10μmol·L-1干预组，每组6孔，分别编号1～6。待细胞贴壁后，阳性对照组加入完全培养基，紫菀酮10μmol·L-1干预组加入终浓度为10μmol·L-1紫菀酮的完全培养基，继续培养2 h后，在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL-1,在1号孔加入RANKL溶液后30 min、40 min、50 min、55 min,分别在2号、3号、4号、5号孔加入RANKL溶液至RANKL终浓度为25 ng·mL-1。在1号孔加入RANKL后60 min,收集各孔细胞，采用蛋白印迹法检测IκBα蛋白的表达量。(6)分析紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组、紫菀酮5μmol·L-1干预组和紫菀酮10μmol·L-1干预组。阳性对照组加入含25 ng·mL-1RANKL的完全培养基，紫菀酮5μmol·L-1干预组和紫菀酮10μmol·L-1干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮和25 ng·mL-1RANKL的完全培养基，培养5 d后，收集各组细胞，采用实时定量PCR检测组织蛋白酶K、空泡型ATP酶d2亚基(vacuolar ATPase subsnit D2,V-ATPase d2)、TRAP的mRNA表达量。(7)分析紫菀酮对活化T-细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)蛋白表达的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10μmol·L-1干预组，每组4孔，分别编号1～4。待细胞贴壁后，阳性对照组加入完全培养基，紫菀酮10μmol·L-1干预组加入终浓度为10μmol·L-1紫菀酮的完全培养基。继续培养2 h后，在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL-1,在1号孔加入RANKL溶液后2 d、4 d,分别在2号、3号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL-1。在1号孔加入RNAKL后5 d,收集各孔细胞。采用蛋白印迹法检测NFATc1蛋白的表达量。结果:(1)紫菀酮对RANKL诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化影响的分析结果。空白对照组之外的5组破骨细胞数比较，差异有统计学意义[(187.667±14.503)个，(180.000±14.422)个，(174.333±11.060)个，(152.667±5.033)个，(130.667±11.015)个，F=11.767,P=0.001]。紫菀酮10μmol·L-1干预组、紫菀酮5μmol·L-1干预组破骨细胞数均少于阳性对照组、紫菀酮1μmol·L-1干预组和紫菀酮2.5μmol·L-1干预组(P=0.004,P=0.000;P=0.017,P=0.000;P=0.047,P=0.001);紫菀酮10μmol·L-1干预组破骨细胞数少于紫菀酮5μmol·L-1干预组(P=0.044)。(2)紫菀酮对Raw 264.7细胞活力影响的分析结果。紫菀酮干预48 h、120 h时，5组Raw 264.7细胞活力比较，组间差异均无统计学意义(48 h:0.960±0.101,0.938±0.051,0.916±0.072,0.915±0.079,1.009±0.105,F=0.647,P=0.641;120 h:1.347±0.161,1.388±0.047,1.423±0.473,1.398±0.067,1.357±0.034,F=0.400,P=0.805)。(3)紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成影响的分析结果。与空白对照组比较，阳性对照组、紫菀酮5μmol·L-1干预组和紫菀酮10μmol·L-1干预组均可见破骨细胞和纤维状肌动蛋白环；与阳性对照组比较，紫菀酮5μmol·L-1干预组和紫菀酮10μmol·L-1干预组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成均受到抑制，且其受到抑制的程度随紫菀酮干预浓度增加而增强。(4)紫菀酮对破骨细胞NF-κB转录活性影响的分析结果。3组荧光素酶相对荧光强度比较，组间差异有统计学意义(0.058±0.003,1.000±0.044,0.753±0.040,F=613.132,P=0.000)。阳性对照组和紫菀酮10μmol·L-1干预组的荧光素酶相对荧光强度高于空白对照组(P=0.000,P=0.000)，紫菀酮10μmol·L-1干预组的荧光素酶荧光强度低于阳性对照组(P=0.000)。(5)紫菀酮对IκBα蛋白表达影响的分析结果。2组破骨细胞IκBα蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈先下降后上升趋势，但2组的趋势不完全一致(1.000±0.000,0.414±0.171,0.285±0.104,0.132±0.021,0.157±0.038,0.802±0.066,F=49.839,P=0.000;0.980±0.130,0.632±0.102,0.347±0.037,0.302±0.070,0.546±0.142,1.502±0.345,F=21.435,P=0.000)；诱导20 min、30 min、60 min，紫菀酮10μmol·L-1干预组破骨细胞IκBα蛋白相对表达量高于阳性对照组(t=-4.018,P=0.016;t=-4.586,P=0.010;t=-3.444,P=0.026)。(6)紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录影响的分析结果。3组破骨细胞V-ATPase-d2、组织蛋白酶K、TRAP的mRNA表达量比较，组间差异均有统计学意义(1.000±0.089,0.879±0.100,0.530±0.054,F=25.553,P=0.001;1.000±0.030,0.725±0.153,0.719±0.111,F=6.293,P=0.034;1.000±0.326,0.834±0.030,0.656±0.327,F=88.003,P=0.000)。紫菀酮5μmol·L-1干预组破骨细胞组织蛋白酶K、TRAP的mRNA表达量均低于阳性对照组(P=0.023,P=0.001)；紫菀酮10μmol·L-1干预组破骨细胞V-ATPase-d2、TRAP的mRNA表达量均低于紫菀酮5μmol·L-1干预组和阳性对照组(P=0.000,P=0.002;P=0.000,P=0.000)；紫菀酮10μmol·L-1干预组破骨细胞组织蛋白酶K的mRNA表达量低于阳性对照组(P=0.021)。(7)紫菀酮对NFATc1蛋白表达影响的分析结果。2组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈上升趋势，但2组的上升趋势不完全一致(1.000±0.000,1.175±0.007,4.700±0.742,19.430±1.763,F=250.352,P=0.000;1.042±0.035,1.334±0.290,3.531±0.583,15.690±0.823,F=525.669,P=0.000)；诱导后5 d，紫菀酮10μmol·L-1干预组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量低于阳性对照组(t=3.329,P=0.029)。结论：紫菀酮能够抑制体外破骨细胞的分化和活性，其作用机制与抑制NF-κB和NFATc1信号通路有关。

• 单位
  广州医科大学附属第五医院; 公共卫生学院; 华北理工大学