Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用机制

作者：陈静; 章晓燕; 张函; 张慧; 滕杰; 吉俊; 丁小强

来源：中华肾病研究电子杂志, 2014, 3(05): 255-261.

• Klotho基因
• 脱氧核糖核酸甲基化
• 硫酸吲哚酚

目的从细胞层面探讨Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚(IS)诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用和相关机制。方法体外培养人主动脉血管平滑肌细胞(HASMC),以IS按0、200、500、1 000μmol/L的浓度梯度干预6 d,采用茜素红染色观察钙盐沉积,Real-time聚合酶链式反应(PCR)和Western印迹检测平滑肌细胞肌动蛋白α(α-SMA)、smoothin、骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)、核结合因子α1(Cbfα1)、Klotho和不同DNA甲基化转移酶(DNMT)的m RNA和蛋白表达水平,同时利用焦磷酸测序方法检测HASMC的Klotho基因甲基化率;在IS 1 000μmol/L组培养基中加入不同浓度梯度的5-氮杂脱氧胞苷(5Aza-2dc)进行干预,观察茜素红染色、各基因表达水平和Klotho基因甲基化率的改变。组间均数比较采用独立样本t检验,组间率的比较采用卡方检验。结果IS 1 000μmol/L组HASMC细胞外基质呈红色,细胞结节处浓染,为钙盐沉积染色阳性。IS可以下调HASMC的α-SMAm RNA和蛋白及smoothin表达水平,上调OPN、ALP的m RNA和蛋白表达水平,使HASMC逐渐丧失平滑肌细胞表型而发生成骨转化。与对照组比较,IS 200、500、1 000μmol/L刺激6 d可显著升高HASMC的Klotho基因甲基化率(9±1%与4±0.7%,t=5.38,P<0.01;18±1.3与4±0.7%,t=6.92,P<0.01;41±2%与4±0.7%,t=9.26,P<0.001)。IS 500、1 000μmol/L可显著下调HASMC的Klotho m RNA和蛋白表达水平。同时IS 1 000μmol/L可显著上调HASMC的DNMT1 m RNA和蛋白表达水平。5Aza-2dc 10μmol/L干预可减轻IS诱导的细胞外钙盐沉积,上调α-SMA蛋白、smoothin表达水平并下调Cbfα1蛋白表达水平,同时减低HASMC的Klotho基因甲基化率(20±1%与41±2%,t=6.98,P<0.01)、上调HASMC的Klotho蛋白表达水平。结论 IS可通过上调血管平滑肌细胞DNMT表达,启动Klotho基因超甲基化,进而下调Klotho基因转录和表达,诱导血管平滑肌细胞成骨转化。

• 单位
  复旦大学附属中山医院