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摘要
胰岛素样生长因子1 (insulin like growth factor 1, IGF1)是通过调控骨骼肌蛋白的合成影响肌肉发育的单链多肽类激素，对细胞增殖等多种生理功能具有重要作用，本研究旨在探究IGF1基因对关岭牛(Bos taurus)成肌细胞的影响。选用健康的成年(2～3岁)关岭牛3头，采集心、肝、脾、肺、肾、前腿肌、后腿肌、背最长肌、斜方肌、臀肌、胃、小肠12个组织样提取RNA，采集背最长肌组织成功培养关岭牛成肌细胞。运用qPCR技术检测IGF1基因在不同组织中的相对表达量；运用在线软件对关岭牛IGF1蛋白质理化性质、二级结构和三级结构、亚细胞定位进行分析；同时通过在线软件设计IGF1基因的3对短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)干扰序列和1对阴性对照序列，与pGPU6-GFP-Neo载体连接后进行测序，将构建成功的IGF1基因干扰载体转染至成肌细胞；运用qPCR技术检测并筛选出干扰效率最高的干扰载体，分析该干扰载体对IGF1基因表达的影响；运用qPCR技术检测干扰IGF1基因对细胞增殖相关基因细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶2 (cyclin-dependent kinases 2, CDK2)的相对表达量影响；运用CCK8 (Cell Counting Kit-8)法检测成肌细胞增殖情况。结果表明，IGF1基因在关岭牛心、前腿肌、后腿肌、背最长肌、斜方肌、臀肌等12个组织样中均有表达，在肝中相对表达量最高，极显著高于其他组织(P<0.01)；在培养关岭牛成肌细胞的基础上，成功构建关岭牛IGF1基因干扰载体，并筛选出shRNA-IGF1-1干扰效率最高(P<0.01);IGF1蛋白的分子式为C744H1186N214O216S15，相对分子质量为17.06581 kD，理论等电点为9.36，属碱性不稳定蛋白；IGF1基因被抑制后，细胞增殖相关基因cyclin D1和CDK2的表达量均极显著低于shRNA-NC (P<0.01)。CCK8法检测细胞增殖结果表明，IGF1基因被抑制后，在24和72 h成肌细胞增殖均显著低于对照组(P<0.05),48 h为极显著水平(P<0.01)，表明体外沉默IGF1基因后，会影响成肌细胞增殖能力和抑制成肌细胞增殖相关基因表达。本研究为进一步研究IGF1基因对关岭牛肌肉生长发育的作用及调控机制提供了基础数据。
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单位贵州大学; 生命科学学院; 动物科学学院
