豆豉AprE9912D血栓溶解酶的制备与活性评价

作者：张秀; 谭正怀^*; 马苗苗; 李晓媛; 周雪

来源：中草药, 2021, 52(02): 367-377.

• 贝莱斯芽孢杆菌
• 过表达
• 安全性
• 溶栓活性
• 血栓溶解酶
• 基因工程技术
• 大肠杆菌

目的通过基因工程技术生产的豆豉血栓溶解酶,研究其安全性及溶栓功效。方法采用酪蛋白平板从豆豉中分离获得具有纤溶活性的候选菌株,利用基因工程技术将其AprE9912D基因在大肠杆菌BL21(DE3)-pDE1中过表达AprE9912D重组蛋白。经过Ni-NTA纯化柱和透析纯化AprE9912D重组蛋白,体外采用纤维蛋白平板、溶解混合血栓考察溶栓作用,体内采用动静脉旁路血栓模型进行功效评价。同时对其安全性进行初步评估。结果经过分子鉴定,筛选出具有纤溶酶活性的菌株是贝莱斯芽孢杆菌9912D(Bacillus velezensis 9912D)。序列分析发现AprE9912D基因的开放阅读框有382个氨基酸,属于S8家族碱性丝氨酸蛋白,使用SWISS-MODEL同源预测AprE9912D蛋白3D模型。经过Ni-NTA柱纯化,AprE9912D纤溶酶蛋白相对分子质量约为36 000。体外测得AprE9912D纤溶酶酶活力为442.6 kU/mg,2.0 kU/mL AprE9912D纤溶酶就能有效溶解混合血栓,其溶解率为40.0%。在体内,4.0 kU/kg能显著抑制动静脉旁路血栓形成,抑制率为32.9%。体外溶血显示AprE9912D纤溶酶93.0 U/mL时,其溶血率为3.33%;测得小鼠静脉注射AprE9912D纤溶酶半数致死量(LD50)>102.6k U/kg。结论 AprE9912D纤溶酶具有活性较强、安全性较高的特点,具有进一步开发的广阔前景。

• 单位
  四川省中医药科学院