大鼠β-arrestin2基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定

作者：陈思思; 周恒; 王继春; 谢菁; 周艳丽; 卢帅; 卢力

来源：贵州医科大学学报, 2020, 45(09): 1025-1030.

DOI：10.19367/j.cnki.2096-8388.2020.09.007

• 质粒
• 慢病毒属
• β-抑制蛋白2基因
• 基因过表达
• 聚合酶链式反应

目的:构建大鼠β-抑制蛋白2(β-arrestin2)基因过表达慢病毒载体并鉴定。方法:取Pubmed数据库中大鼠β-arrestin2的c DNA序列合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增获取大鼠β-arrestin2基因;采用琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收PCR产物并对其进行纯化;取限制性内切酶Bam HI/Age I酶切载体质粒和纯化后的PCR产物,将二者实施连接后转化感受态细胞,挑取菌落进行PCR鉴定,并对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对抽提质粒;将β-arrestin2重组质粒与慢病毒辅助包装质粒共转染至293T细胞,获取病毒粗提液并进行扩增、纯化,稀释法测定病毒滴度、荧光显微镜下观察慢病毒感染效率。结果:PCR扩增所得产物大小为1 274 bp,与Pubmed数据库中该基因片段大小一致;阳性转化子的PCR产物大小为728 bp,对比Pubmed数据库中大鼠Arrb2基因序列,上下游引物基因序列大小与转化子PCR产物结果一致;慢病毒包装完成后病毒滴度为5×1011TU/L,病毒感染效率较高。结论:成功构建了携带大鼠β-arrestin2基因的慢病毒载体,目的基因在转染细胞内能稳定高表达。

• 单位
  武汉大学; 武汉大学人民医院