CRISPR/Cas9基因编辑技术在脑退行性疾病研究中的应用及问题

作者：孙安阳; 张骑鹏

来源：神经药理学报, 2018, 8(02): 61.

• CRISPR/Cas9
• 基因编辑
• 基因敲除
• 基因敲入
• 神经退行性疾病

CRISPR/Cas9基因编辑技术自2012年报道以来,经过不断改进后已展示物种普适性、高效与较高通量、低成本等优点,成为现阶段最常用的基因编辑技术。在神经科学领域,CRISPR/Cas9技术不仅可应用于离体神经细胞,也可以在受精卵、胚胎、成年时期应用,在体脑组织水平产生效应;应用目的涉及脑基因与功能研究、基因敲除/敲入小鼠模型的构建、某些神经系统疾病的实验性治疗等。在脑退行性疾病研究中,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经用于亨廷顿病小鼠模型(HD140Q基因敲入小鼠)的实验性治疗,初步展示了令人鼓舞的治疗效果。腺相关病毒AAV是无包膜的单链DNA缺陷型病毒,对分裂细胞或非分裂细胞均可感染,但通常无致病性。成年小鼠实施脑CRISPR/Cas9基因编辑的常用方法是AAV病毒混合物注射,但在实际应用中尚有多个技术问题尚待解决。例如,(1)在小鼠海马部位注射AAV后,基因编辑较易发生在齿状回,但CA1区神经元胞体尚难实现高效率基因编辑。(2)AAV病毒装载容量相对小,如用经典的化脓链球菌Cas9酶(SpCas9)和MECP2启动子,SpCas9通常需要与gRNA分开包装。替代方法包括使用较小的金黄色葡萄球菌的SaCas9酶,或者使用容量较大的整合酶缺陷慢病毒,但这两种替代方法都存在一些局限性。(3)总体上,目前脑内神经元的基因编辑效率比较低,即使Salk研究所Belmonte实验室建立的同源非依赖性靶向嵌入(homology-independent targeted integration,HITI)改良方法,小鼠脑内注射仅有视皮层的资料,实际编辑效率也显著低于5%。本实验室试验了神经元特异性新型小启动子,以期可将SpCas9与gRNA包装进单一AAV载体,这方面的尝试取得了初步成功。未来还将试验高效病毒载体AAV-PHP.B的在体应用效果,以期提升在体脑神经元的基因编辑效率。未来,如何实现高效、安全的CRISPR/Cas9体内递送(in vivo),仍然是一个具有挑战性的难题。

• 单位
  上海健康医学院