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摘要
【目的】建立快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体的间接ELISA方法。【方法】根据GenBank收录的ASFV分离株全基因组中的CP204L基因序列，在不影响氨基酸序列的前提下进行密码子优化，克隆到pCold TF冷休克表达载体，构建重组质粒pCold TF-p30。利用大肠杆菌原核表达系统进行IPTG诱导表达并对诱导时间和诱导浓度进行优化。用His标签镍柱对重组蛋白P30进行纯化，通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定后，用纯化后的P30重组蛋白作为抗原，建立ASFV抗体间接ELISA检测方法并对反应条件进行优化，检验该方法的特异性、灵敏性和重复性，并用该方法与商品化试剂盒进行对比。【结果】重组质粒成功转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导后以可溶性蛋白形式表达，在约82 ku处有目的蛋白特异性条带。当16℃诱导12 h时蛋白表达量最高，不同IPTG浓度诱导无明显差异。Western blotting结果显示，P30重组蛋白可与ASFV阳性血清产生特异性反应，表明其具有良好的反应原性。建立的ASFV抗体间接ELISA检测方法抗原最佳包被浓度为1μg/mL,使用1%BSA溶液封闭效果最佳，血清最佳稀释度为1∶600,酶标二抗最佳工作浓度为1∶8 000,该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性，与商品化试剂盒总符合率达到96.7%。【结论】本试验成功表达并纯化了ASFV的P30蛋白，建立了ASFV抗体间接ELISA检测方法，为非洲猪瘟的监测、诊断及试剂盒开发提供了参考。
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