摘要
目的探索基于显微注射方法构建胶质母细胞瘤(GBM)融合大脑类器官模型的可行性, 观察该模型肿瘤组织对替莫唑胺(TMZ)的敏感性。方法 GBM组织和脑肿瘤旁组织标本(定义为正常脑组织)来源于中南大学湘雅医院神经外科行手术治疗的患者。采用绿色荧光蛋白(GFP)标记过的人诱导多能干细胞株(hiPSCs)培养24 d构建大脑类器官模型, 通过免疫荧光染色方法检测蛋白标志物的表达, 评估模型是否成功建立。采用显微注射方法将用红色荧光染料标记过的患者来源的GBM单细胞或U-251 MG细胞株注射到培养约30 d的大脑类器官中, 构建GBM融合大脑类器官模型。采用免疫荧光染色法、HE染色等方法观察GBM细胞在大脑类器官中的增殖及浸润情况。采用免疫荧光染色法检测GBM融合大脑类器官中肿瘤细胞基质金属蛋白酶类(MMPs)及BrdU的表达情况, 采用HE染色观察形态及结构变化。将10 μmol/L TMZ加入GBM融合大脑类器官模型及GBM肿瘤类组织中培养48 h, 采用免疫荧光染色法检测两种模型中Caspase-3的表达。结果 (1)hiPSCs培养至第24天, 形成具有明确芽和分层边缘的块状组织样结构;免疫荧光染色显示, 该结构阳性表达前脑、脑室样结构、前额叶皮质及海马的标志蛋白FOXG1、N-cadherin、Auts2及Frizzled 9, 以及星形胶质细胞标志蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元标志蛋白TUJ1。(2)荧光显微镜下及HE染色均显示肿瘤细胞在大脑类器官内快速增殖, 呈浸润性生长。免疫荧光检测显示, 与大脑类器官比较, GBM融合大脑类器官的肿瘤细胞中, MMP2和MMP13的表达明显增加, Fibronectin、MMP3及MMP9的表达明显减弱, 差异均有统计学意义(均P<0.05), MMP10的表达差异无统计学意义(P>0.05);GFAP和BrdU的表达水平均增高(均P<0.05)。(3)TMZ处理48 h后, 免疫荧光染色显示, GBM类肿瘤组织中Caspase-3的表达明显高于GBM融合大脑类器官。结论采用显微注射方法能够成功构建GBM融合大脑类器官模型。该模型中的肿瘤组织对TMZ的敏感性低于GBM肿瘤类组织。
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