CK18基因的原核表达及蛋白纯化

作者：倪佳; 王伟; 徐莹莹; 陈相屹; 张欣; 孙达权^*

来源：贵州医科大学学报, 2022, 47(09): 1025-1030.

DOI：10.19367/j.cnki.2096-8388.2022.09.006

• 细胞角蛋白18(CK18)
• 聚合酶链式反应
• 基因克隆
• 原核表达
• 蛋白纯化
• 肝癌

目的 采用原核表达和亲和层析的方法获得人细胞角蛋白18(CK18)。方法 利用高保真聚合酶链式反应（PCR）法克隆人CK18基因的蛋白编码区，TA克隆入pMD18-T载体中；经筛选和鉴定后，将CK18基因编码区插入原核表达载体pGEX-4t-1中，构建重组质粒pGEX-CK18GST；将重组质粒导入感受态细菌Rosetta(DE3)中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导CK18融合蛋白（GST-CK18）表达，并用GST亲和层析分离纯化CK18蛋白；用体外磷酸化、免疫组化等方法验证CK18磷酸化位点及其对细胞的影响。结果 成功克隆人CK18基因蛋白编码区，构建了原核表达质粒pGEX-CK18GST，表达了GST-CK18并获得纯化蛋白，体外磷酸化、免组织化学方法均证实CK18的52位丝氨酸磷酸化可以导致细胞骨架重排和细胞形态变化。结论 成功获得纯化的人CK18蛋白，为体外研究CK18和蛋白激酶之间的关系奠定了前期基础。

• 单位
  宁波市第一医院; 基础医学院; 贵阳市妇幼保健院; 贵州医科大学; 贵阳市儿童医院