慢病毒介导NEP1-40及NT-3双基因转染神经干细胞的实验研究

作者：王林楠; 汪雷; 宋跃明; 刘立岷; 杨曦; 丰干均; 周春光

来源：中国修复重建外科杂志, 2018, 32(04): 420-427.

DOI：10.7507/1002-1892.201710079

• 神经干细胞
• NEP1-40
• 神经营养因子3
• 慢病毒载体
• 转染

目的通过慢病毒载体将NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)及神经营养因子3(neurotrophin 3,NT-3)双基因转染入神经干细胞(neural stem cells,NSCs)内进行表达,探讨NEP1-40及NT-3双基因转染NSCs的可行性,为NSCs体内实验奠定基础。方法将SD大鼠胚胎室管膜区NSCs采用空载慢病毒载体(A组)、NEP1-40慢病毒载体(B组)、NT-3慢病毒载体(C组)及NEP1-40和NT-3慢病毒载体(D组)进行转染,以未转染病毒的细胞作为对照组(E组)。用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5、10、15的慢病毒载体分别转染24、48、72 h,荧光显微镜观察转染后细胞内荧光表达情况,确定慢病毒载体的最佳MOI和收样时间。再分别通过实时荧光定量PCR及Western blot,检测转染后细胞中NEP1-40及NT-3基因的表达,以及细胞和培养基中NEP1-40及NT-3蛋白的表达。结果荧光显微镜观察示,MOI为10时NEP1-40和NT-3基因慢病毒载体在NSCs内转染率最高,最佳时间为转染48 h时。实时荧光定量PCR及Western blot检测示,B、D组NEP1-40 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、C组,差异有统计学意义(P<0.05);A、C组间及B、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。C、D组NT-3 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、B组,差异有统计学意义(P<0.05);A、B组间和C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过慢病毒载体可将NEP1-40及NT-3双基因成功转染入NSCs内,在NSCs内稳定表达,且两种目的基因在表达过程中无相互拮抗或促进作用。

• 单位
  四川大学华西医院