含有WW结构域的泛素蛋白连接酶1降解依托泊苷诱导蛋白24并促进肝癌细胞增殖

作者：张勤; 黄安中; 沈冯佳; 俞建平; 秦春枝^*

来源：中华肿瘤杂志, 2020, 42(03).

• WW结构域的泛素蛋白连接酶1
• 依托泊苷诱导蛋白24
• 肝肿瘤
• 泛素连接酶
• 蛋白降解

目的筛选含有WW结构域的泛素蛋白连接酶1(WWP1)相互作用蛋白, 探讨WWP1和依托泊苷诱导蛋白24(EI24)对肝癌细胞增殖的影响。方法利用酵母双杂交的方法筛选与WWP1相互作用的蛋白, 并利用免疫共沉淀来进行相互作用验证。通过体内泛素化实验验证泛素连接酶WWP1与EI24酶和底物的关系。以慢病毒感染的方法建立WWP1和EI24稳定过表达或敲低表达的肝癌细胞系。通过细胞增殖实验、平板克隆实验和裸鼠成瘤实验检测WWP1和EI24对肝癌细胞增殖的影响。结果 WWP1可以与底物EI24相互作用, 并能够在体内将EI24泛素化降解。成功构建稳定过表达或敲低表达的WWP1和EI24的肝癌细胞系HepG2。在HepG2细胞中, 过表达WWP1可以降低内源EI24的蛋白水平, 而敲低WWP1可以使EI24蛋白水平增加。细胞计数盒8(CCK-8)法检测结果表明, 在36 h时, WWP1过表达组和shWWP1组细胞的相对增殖活性分别为(347.00±8.15)%和(187.08±4.86)%, 与对照组(270.33±15.01)%比较, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。在36 h时, EI24过表达组和shEI24组细胞的增殖活性分别为(183.75±8.11)%和(317.33±9.60)%, 与对照组(270.33±15.01)%比较, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。克隆形成实验结果显示, 对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的克隆形成数分别为(52±7)个/视野、(76±4)个/视野和(19±3)个/视野, WWP1过表达组细胞克隆形成明显增多(P<0.05), 而敲低WWP1后细胞克隆形成较对照组减少(P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的克隆形成数分别为(38±4)个/视野、(10±3)个/视野和(69±7)个/视野。与对照组比较, 过表达EI24使细胞克隆形成明显减少(P<0.05), 敲低EI24的表达使细胞克隆形成明显增多(P<0.05)。裸鼠体内实验结果显示, 经过4周同等条件喂养后, 对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1 400.00±43.71)mm3、(2 636.67±290.45)mm3和(642.17±36.00)mm3, 差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.23±0.08)g、(2.05±0.17)g和(0.88±0.09)g, 差异均有统计学意义(P<0.05)。WWP1过表达组细胞成瘤能力明显增强, shWWP1组成瘤能力明显减弱。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1 245.17±93.10)mm3、(662.17±60.88)mm3和(1 986.67±226.75)mm3, 差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.15±0.04) g、(0.85±0.02)g和(1.73±0.05)g, 差异有统计学意义(P<0.05)。EI24过表达组细胞成瘤能力明显减弱, shEI24组成瘤能力明显增强。结论 WWP1可以靶向底物EI24进行泛素化降解, 并促进肝癌细胞的增殖。

• 单位
  复旦大学附属金山医院