科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的探讨LncRNA-MEG3及Rac1/Cdc42/PAK1信号通路在先天性巨结肠(Hirschsprung disease, HSCR)发病机制中的作用及机制。方法收集2016年1月至2018年12月在遵义医科大学附属医院病理确诊HSCR并手术治疗的患儿结肠组织标本30例为实验组(HSCR组), 其中男23例, 女7例;年龄为(18.86±1.78)个月;体重为(4.56±0.19)kg。收集非先天性消化道畸形、非肠神经相关疾病手术切除肠管患儿14例组织标本为对照组(Normal组), 包括坏死性小肠结肠炎、嵌顿疝和肠套叠造瘘患儿在闭瘘手术时吻合处正常肠管, 其中男10例, 女4例;年龄为(16.73±1.03)个月, 体重为(5.01±0.20)kg。采用qRT-PCR和Western blot检测HSCR组与Normal组中MEG3和Rac1/Cdc42/PAK1信号通路各蛋白的表达水平。在SH-SY5Y细胞中通过转染MEG3过表达质粒以及加入通路抑制剂AZA1构建细胞模型, 并分为4组:①空白对照组(Control组), 仅有SH-SY5Y细胞;②空载体组(pcDNA3.1组), SH-SY5Y细胞+pcDNA3.1质粒;③MEG3过表达组(MEG3组), SH-SY5Y细胞+pcDNA3.1-MEG3质粒;④抑制剂组(MEG3+AZA1组), SH-SY5Y细胞+pcDNA3.1-MEG3+AZA1抑制剂。采用Western blot、CCK-8和Transwell方法检测各组细胞中Rac1、Cdc42、PAK1及P-PAK1蛋白表达量以及细胞增殖和迁移能力。两组间数据在进行方差同质性检验后采用两独立样本t检验比较, 多组数据之间的比较采用单因素方差分析。若总体方差不齐, 采用修正的界限值或Tamhane’’s T2检验;非正态分布的计量资料, 采用多独立样本比较的秩和检验。结果 HSCR患儿狭窄段肠管组织中MEG3、Rac1、Cdc42、PAK1和P-PAK1蛋白表达量均较Normal组低(Rac1:0.20±0.05比0.78±0.05, t=8.37;Cdc42:0.38±0.08比1.03±0.08, t=5.68;PAK1:0.27±0.02比1.10±0.06, t=13.52;P-PAK1:0.24±0.03比1.07±0.06, t=12.99;P均<0.01);在细胞模型中, MEG3组细胞中Rac1、Cdc42、PAK1和P-PAK1蛋白相对表达量均高于Control组和MEG3+AZA1组(Rac1:0.96±0.05比0.36±0.11比0.75±0.20, F=3.46, P<0.05;Cdc42:1.12±0.08比0.53±0.19比0.68±0.10, F=5.37, P<0.01;PAK1:1.02±0.09比0.55±0.14比0.47±0.14, F=5.60, P<0.05;P-PAK1:0.97±0.07比0.66±0.08比0.47±0.03, F=15.66, P<0.05), MEG3组细胞中MEG3表达量明显高于Control组和pcDNA3.1组(1.00±0.20比0.14±0.04比0.02±0.01, F=20.56, P<0.01), Control组和pcDNA3.1组中MEG3相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。MEG3组细胞增殖能力高于Control组及MEG3+AZA1组(12 h:0.19±0.00比0.19±0.00比0.18±0.00, P>0.05;24 h:0.21±0.00比0.19±0.01比0.17±0.00, F=12.00, P<0.01;48 h:0.30±0.02比0.26±0.00比0.22±0.01, F=9.60, P<0.05)。MEG3组细胞迁徙数量明显高于Control组(141.67±11.93比96.33±8.02, t=3.15, P<0.05), MEG3+AZA1组细胞迁徙数量低于MEG3组和Control组(71.00±7.00比141.67±11.93比96.33±8.02, F=15.04, P<0.01)。结论低表达的MEG3可能通过调控Rac1/Cdc42/PAK1信号通路抑制神经嵴细胞增殖和迁移能力, 可能与HSCR发生有关。
- 单位
