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摘要
目的比较细粒棘球绦虫丝氨酸蛋白酶(Eg SP)在原头节、生发层(包囊)和成虫中的表达水平差异及活性鉴定。方法采用TRIzol试剂分别提取细粒棘球绦虫原头节(经胃蛋白酶消化和未经胃蛋白酶消化)、生发层(包囊)和成虫总RNA,并进行PCR分别扩增Eg SP基因片段,PCR扩增产物测序后通过Clustal×2.0软件进行序列比对,采用邻接法构建系统进化树。选择具有SP活性基团的38 000亚基基因序列进行原核表达,将正确的目的片段克隆至表达载体pET-30a中,再转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用His标签亲和层析纯化柱纯化重组蛋白Eg SP (r Eg SP)。将r Eg SP (25μg)与等量的弗氏完全佐剂混合乳化,皮下多点注射免疫5只BALB/c小鼠,从第2次免疫开始,改为等量的弗氏不完全佐剂,第4次加强免疫采用腹腔注射,每次免疫间隔1周。免疫结束后,尾静脉采血,分离血清。ELISA检测血清中特异性抗体水平。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)测定不同阶段中Eg SP mRNA的相对表达水平。蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测细粒棘球绦虫不同阶段中Eg SP的表达情况,采用Image Lab 6.0软件分析蛋白质的表达丰度。免疫组化检测Eg SP在细粒棘球绦虫原头节和生发层(包囊)中的表达情况。纯化的r Eg SP和囊液蛋白用胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸酶底物(Z-Arg-AMC)、组织蛋白酶L底物(Z-Phe-Arg-AMC)测定其蛋白酶活性。采用Graphpad Prism 7统计学软件对多组数据进行单因素ANOVA方差分析。结果细粒棘球绦虫原头节、生发层(包囊)和成虫的cDNA中均扩增出目的片段,与预期大小(1 455 bp)相符。PCR产物测序结果显示,Eg SP开放阅读框为1 455 bp,编码484个氨基酸,相对分子质量(Mr)为54 870,与多房棘球绦虫丝氨酸蛋白酶(Em SP)核苷酸序列一致性为97.73%,氨基酸序列一致性为96.69%。系统进化树分析结果显示,与其他绦虫属氨基酸序列一致性为33.10%～87.19%,其中与亚洲带绦虫(GenBank登录号:VDK43949.1),带状泡尾绦虫(GenBank登录号:VDM30859.1)的氨基酸序列一致性分别为87.19%、 52.89%。qRT-PCR结果显示,胃蛋白酶消化的原头节、生发层(包囊)、成虫中Eg SP mRNA的相对转录水平分别为2.1±1.2、 9.1±2.1、 5.8±2.3,均高于未经胃蛋白酶消化的原头节(1.0±0)(P <0.01)。Western blotting分析结果显示,原头节、生发层(包囊)、成虫中Eg SP蛋白相对表达水平分别为1.2±0.1, 3.6±0.2, 4.0±0.1,生发层(包囊)和成虫中的表达水平高于原头节(P <0.01)。免疫组化分析结果显示,Eg SP多克隆抗体能够特异性在生发层(包囊)中表达,而在原头节中不表达。在3种不同pH缓冲液中,r Eg SP和囊液蛋白均具有蛋白酶活性,且在pH7.2的缓冲液中,r Eg SP和囊液蛋白丝氨酸蛋白酶活性最强(P <0.01)。结论Eg SP在细粒棘球绦虫生发层(包囊)和成虫组织中高表达,原头节中表达较低。r Eg SP和囊液蛋白均具有较强的丝氨酸蛋白酶活性。
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单位基础医学院; 新疆医科大学第一附属医院; 新疆医科大学
