慢病毒介导的bta-miR-222稳定过表达MDBK细胞株的构建及鉴定

作者：钟纯燕; 主性^*; 李基棕^*; 毛立; 李文良; 郝飞; 刘茂军; 嵇辛勤; 肖芳

来源：中国兽医科学, 2019, 49(01): 50-57.

DOI：10.16656/j.issn.1673-4696.2019.0001

• bta-miR-222
• MDBK细胞
• 慢病毒

拟获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为后续探索bta-miR-222在MDBK细胞中的作用奠定基础。本研究使用PCR技术,从MDBK细胞基因组与pEGFP-N1质粒中扩增pri-bta-miR-222和GFP片段,胶回收,先克隆于pMD18-T载体中,转化入大肠杆菌,酶切鉴定及测序正确,再克隆于pCDH-CMVMCS-EF1-Puro载体,构建含bta-miR-222基因的miRNA慢病毒重组质粒pCDH-miR-222-GFP。将pCDHmiR-222-GFP与两个包装质粒PSP、PMD共转染293T细胞,制备含bta-miR-222基因的重组慢病毒VPCDH+miR-222。用制备成功的慢病毒VPCDH+miR-222感染MDBK细胞,经Puromycin嘌呤霉素筛选,荧光显微镜观察感染效率。结果显示,pCDH-miR-222-GFP过表达质粒构建成功,序列比对符合率达100%。将pCDH-miR-222-GFP、PSP和PMD共转染后,通过荧光显微镜观察到293T细胞分布大量的荧光,说明成功构建了重组慢病毒VPCDH+miR-222,经Puromycin嘌呤霉素筛选10代后,VPCDH+miR-222在MDBK细胞中仍具有感染效率。本研究成功获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为进一步研究bta-miR-222在病毒感染MDBK细胞中的功能奠定了基础。

• 单位
  农业部; 动物科学学院; 江苏省农业科学院; 贵州大学