环状RNA0001287(circ＿0001287)和miR-21在糖尿病视网膜病变发病过程中的作用机制

作者：陈妍鹏; 顾婕; 袁沣; 温登慧

来源：眼科新进展, 2023, 43(12): 946-951.

DOI：10.13389/j.cnki.rao.2023.0188

• 环状RNA0001287
• miR-21
• PTEN
• 糖尿病视网膜病变
• 视网膜色素上皮

目的 探讨环状RNA0001287(circ＿0001287)和miR-21在糖尿病视网膜病变(DR)发病过程中的作用机制。方法 分离原代人RPE(phRPE)细胞用于circRNA芯片分析。体外培养ARPE-19细胞，并分为空白组、高糖组、阴性组、si-circ组、circ＿0001287组、circ＿0001287+阴性组、circ＿0001287+miR-21组。构建抗circ＿0001287的小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸和含有靶向miR-21序列的模拟物以及miR-21 mimics质粒。阴性组、si-circ组、circ＿0001287组、circ＿0001287+阴性组、circ＿0001287+miR-21组分别采用Lipofectamine2000试剂盒将空质粒、circ＿0001287 siRNA、circ＿0001287模拟物、circ＿0001287模拟物+miRNA无序序列、circ＿0001287模拟物+miR-21 mimics质粒转染到ARPE-19细胞。转染6 h后，用新鲜的正常培养基更换Opti-MEM培养基。空白组和高糖组细胞不作转染处理。空白组细胞用含5.5 mmol·L-1葡萄糖的培养液培养，高糖组细胞逐次用含15.5 mmol·L-1、25.5 mmol·L-1、35.5 mmol·L-1葡萄糖的培养液培养。而其余各组细胞用35.5 mmol·L-1葡萄糖处理48 h。采用RT-PCR检测circ＿0001287和miR-21表达情况，CCK-8实验检测细胞增殖活性，双荧光素酶报告基因检测circ＿0001287和miR-21的靶向关系，RNA免疫沉淀(RIP)法和生物素偶联探针Pull-down法验证circ＿0001287和miR-21的靶向关系，Western blot法检测蛋白表达情况。结果 circRNA芯片筛选发现，hsa＿circ＿0001287在phRPE细胞中的表达下调。RT-PCR检测结果显示：与空白组相比，高糖组ARPE-19细胞中circ＿0001287表达降低(P<0.05),并且具有剂量依赖性，而且随着葡萄糖浓度的增加，ARPE-19细胞中miR-21表达逐渐升高(P<0.05)。将siRNA与circ＿0001287模拟物共转染，siRNA也能减少circ＿0001287表达，表现为circ＿0001287+阴性组circ＿0001287相对表达量(0.70±0.03)较阴性组(0.98±0.04)显著降低(P<0.05)。对于转染circ＿0001287-WT质粒的细胞，与对照模拟组(0.98±0.03)相比，miR-21模拟组荧光素酶相对酶活性降低(0.59±0.02,P<0.05);然而，对于转染circ＿0001287-MUT质粒的细胞，对照模拟组和miR-21模拟组荧光素酶相对酶活性几乎一致(分别为0.96±0.05和1.00±0.04,P>0.05)。在抗Ago RIP实验中，与对照组相比，circ＿0001287组中miR-21明显富集，表明miR-21可被生物素化circ＿0001287探针显著下拉；Pull-down分析结果显示：与对照IgG相比，circ＿0001287特异性探针下拉样品中circ＿0001287和miR-21显著富集。在本实验中，circ＿0001287+miR-21组细胞增殖率(78.25%±3.01%)低于circ＿0001287+阴性组(90.88%±3.51%,P<0.05)。与空白组相比，用35.5 mmol·L-1葡萄糖处理的高糖组ARPE-19细胞PTEN蛋白表达显著下调(P<0.05),而circ＿0001287组ARPE-19细胞PTEN蛋白表达较阴性组增加(P<0.05),circ＿0001287+miR-21组ARPE-19细胞PTEN蛋白表达量则高于circ＿0001287组(P<0.05)。结论 circ＿0001287在phRPE细胞和高糖诱导的ARPE-19细胞中表达下调，上调circ＿0001287可通过吸附miR-21和激活PTEN表达从而抑制糖尿病性RPE细胞损伤。

• 单位
  河北北方学院附属第一医院