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摘要
目的检测多房棘球蚴感染后小鼠肝脏和肝细胞血管内皮细胞生长因子A (VEGFA)、血管内皮细胞生长因子受体2 (VEGFR2)的mRNA水平及蛋白水平,探讨VEGFA/VEGFR2在多房棘球蚴组织血管生成中的作用。方法将20只雌性C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组(10只/组),实验组小鼠采用肝被膜注射法建立多房棘球蚴感染模型,对照组注射等量生理盐水。于感染后第0、 16、 37、 58、 81、 105天,收集各组小鼠全血,分离血清。第120天安乐死小鼠后,开腹观察多房棘球蚴生长情况,取小鼠多房棘球蚴组织、多房棘球蚴周围肝组织、对照组小鼠正常肝组织。HE染色观察多房棘球蚴组织血管生成情况,免疫组化法检测各组织中VEGFA、 VEGFR2表达及分布。取肝细胞和原头节进行体外培养,36个培养皿均分为共培养组(肝细胞+原头节)、肝细胞组、原头节组,分别于培养后1、 2、 3 d后取各组上清、肝细胞和原头节。qRT-PCR、蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测正常肝组织、多房棘球蚴组织、多房棘球蚴周围4 mm处肝组织、原头节和肝细胞中VEGFA、 VEGFR2 mRNA水平和蛋白水平。ELISA检测外周血中VEGFA的含量、正常肝组织、多房棘球蚴组织、多房棘球蚴周围肝组织、共培养组上清、肝细胞组上清和原头节组上清中VEGFA蛋白水平。采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。结果 qRT-PCR检测结果显示,正常肝组织、多房棘球蚴周围肝组织、多房棘球蚴组织VEGFA mRNA相对转录水平分别为1.033±0.102、 1.222±0.501、 0.276±0.092,多房棘球蚴组织的转录水平低于正常肝组织与多房棘球蚴周围肝组织(P <0.05); VEGFR2 mRNA相对转录水平分别为1.042±0.071、 1.836±0.062、 0.226±0.077,多房棘球蚴周围肝组织的转录水平高于正常肝组织(P <0.01),多房棘球蚴组织的转录水平低于正常肝组织与多房棘球蚴周围肝组织(P <0.01)。Western blotting分析结果显示,多房棘球蚴组织蛋白样品中未检出GAPDH、 VEGFA和VEGFR2目的蛋白。多房棘球蚴周围肝组织、正常肝组织中,VEGFA蛋白相对表达量分别为0.920±0.961、 0.816±0.129; VEGFR2蛋白相对表达量分别为1.439±0.160、 0.515±0.222,二者差异有统计学意义(P <0.05)。ELISA检测结果显示,正常肝组织、多房棘球蚴周围肝组织、多房棘球蚴组织VEGFA含量分别为(6.581±0.722)、(6.363±0.638)、(0.670±0.105) pg。免疫组化检测结果显示,正常肝组织、多房棘球蚴周围肝组织、多房棘球蚴组织VEGFA评分分别为3.552±0.683、 3.355±0.807、 9.450±1.292,多房棘球蚴组织VEGFA表达高于正常肝组织和多房棘球蚴周围肝组织(P <0.05)。正常肝组织、多房棘球蚴周围肝组织、多房棘球蚴组织VEGFR2评分分别为0.361±0.547、 4.093±1.042、 5.275±1.003,多房棘球蚴周围肝组织、多房棘球蚴组织VEGFR2的表达均高于正常肝组织(P <0.01)。ELISA检测结果显示,实验组小鼠第0、 16、 37、 58、 81、 105天外周血VEGFA含量分别为(73.233±7.651)、(156.925±5.111)、(176.571±40.343)、(204.212±9.601)、(201.335±24.161)和(185.745±37.902) pg/ml,对照组分别为(70.355±24.751)、(56.144±14.736)、(81.094±13.753)、(76.172±5.689)、(64.393±19.060)和(70.871±23.966) pg/ml,实验组小鼠外周血VEGFA含量高于对照组(P <0.05)。qRT-PCR检测结果显示,体外培养第2天,共培养组VEGFA、 VEGFR2 mRNA相对转录水平分别为9.380±1.165和2.764±0.871,肝细胞组分别为1.028±0.252和1.062±0.201,共培养组VEGFA、 VEGFR2转录水平均高于相应肝细胞组(P <0.05)。Western blotting结果显示,体外培养第2天,共培养组VEGFA、 VEGFR2蛋白相对表达水平分别为1.500±0.148和1.540±0.079,肝细胞组分别为1.322±0.050和0.303±0.003,原头节组高于肝细胞组(P <0.01)。ELISA检测结果显示,肝细胞组上清第1、 2、 3天VEGFA含量分别为(24.923±1.427)、(151.760±4.282)、(223.033±10.061) pg/ml;共培养组分别为(95.218±4.932)、(240.295±15.121)、(366.148±4.822) pg/ml,共培养组各时间点VEGFA含量均高于相应肝细胞组(P <0.01)。结论多房棘球蚴感染后宿主细胞持续性高表达VEGFA、以分泌形式扩散至周围组织后进入血液循环,诱导周围细胞高表达VEGFR2并靶向感染部位迁移,促进多房棘球蚴组织血管生成。
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单位石河子大学; 石河子大学医学院第一附属医院
