摘要
目的 探讨微小RNA-34家族(miR-34s)对结直肠癌细胞同源重组修复的作用及调控机制。方法 分别在2种结直肠癌细胞系(HCT116和HT29细胞)和2种非结直肠癌细胞系(HeLa和U2OS细胞)中过表达miR-34c-5p,应用蛋白质印迹法检测polo样激酶1(PLK1)蛋白表达水平。过表达miR-34a-5p、miR-34b-5p和miR-34c-5p以及回转PLK1,应用蛋白质印迹法检测PLK1和第139位丝氨酸磷酸化的组蛋白H2AX(γH2AX)蛋白表达水平,分析miR-34s与PLK1以及DNA损伤的关系。使用DR-GFP/Ⅰ-SceI报告质粒检测miR-34a-5p、miR-34b-5p和miR-34c-5p对同源重组修复效率的影响。qRT-PCR法检测miR-34a-5p、miR-34b-5p和miR-34c-5p对PLK1 mRNA表达水平的影响。生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验验证miR-34a-5p、miR-34b-5p和miR-34c-5p与PLK1 mRNA的结合位点。分别在p53wt和p53-/-HCT116细胞中过表达miR-34a-5p、miR-34b-5p和miR-34c-5p,分析p53在PLK1调控过程中的作用。结果 miR-34c-5p在HCT116、HT29、HeLa、U2OS细胞中均可抑制PLK1蛋白表达,t值分别为13.317、8.129、6.802和15.934,均P<0.001。过表达miR-34a-5p、miR-34b-5p和miR-34c-5p可抑制PLK1蛋白(F=44.191,P<0.001)和mRNA(F=26.076,P<0.001)表达水平以及上调γH2AX蛋白表达水平(F=5.368,P=0.026),回转PLK1可部分逆转DNA损伤。过表达miR-34a-5p、miR-34b-5p和miR-34c-5p可降低结直肠癌细胞同源重组修复效率,F=200.739,P<0.001。双荧光素酶报告基因分析显示,miR-34a-5p可靶向结合PLK1 mRNA 3′-UTR。过表达miR-34a-5p、miR-34b-5p和miR-34c-5p均能明显上调p53蛋白(F=6.100,P=0.018)以及mRNA(F=17.401,P=0.001)表达水平。在HCT116 p53-/-细胞中,miR-34a-5p对PLK1 mRNA及蛋白的抑制作用明显减弱,t值分别为-6.471和-4.056,均P<0.05;而miR-34b-5p和miR-34c-5p对PLK1 mRNA及蛋白的抑制作用消失,均P>0.05。结论 miR-34s可通过下调PLK1表达水平抑制结直肠癌细胞同源重组修复以及诱导DNA损伤的积累。