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摘要
为探究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的分子机制。本研究构建BVDVC蛋白真核表达质粒pCMV-C，经PCR和测序鉴定正确后转染牛睾丸原代(BT)细胞，48 h采用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测C蛋白的表达；采用CCK-8法检测转染pCMV-C(过表达C蛋白)的BT细胞活性。结果显示，该BT细胞出现特异性绿色荧光，且在23 ku处出现特异性条带，阴性对照细胞(转染pCMV的细胞，后同)未见绿色荧光也无该条带，表明C蛋白在BT细胞中获得了表达。细胞活性检测结果显示，过表达C蛋白的BT细胞活性极显著低于阴性对照组细胞(P<0.001)。将荧光素酶报告质粒pNF-κB-Luc、内参质粒p RL-TK和pCMV-C共转染BT细胞，并设置相应的阳性和阴性对照，48 h后采用双荧光素酶报告系统检测各组细胞上清中NF-κB的相对荧光素酶活性。结果显示，共转染3种质粒的BT细胞及阳性对照细胞中NF-κB相对荧光素酶活性极显著高于空白对照组和阴性对照组(共转染pCMV、pNF-κB-Luc和p RL-TK的细胞)(P<0.01)。通过荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)分别检测过表达C蛋白的BT细胞中NLRP3炎症小体组分[Caspase-1前体(pro-Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、NLRP3及IL-1β的前体(pro-IL-1β)] mRNA的转录水平；采用western blot检测该BT细胞中NLRP3炎症小体组分(pro-Caspas-1、ASC、NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的表达水平并通过western blot分析pro-Caspase-1和pro IL-1β的切割结果。结果显示，过表达C蛋白的BT细胞中NLRP3和ASC mRNA转录水平(P<0.01)、pro-Caspase-1和pro-IL-1βmRNA转录水平(P<0.001)均极显著高于阴性对照组细胞；该BT细胞中NLRP3、 pro-Caspase-1、 Caspase-1P20、ASC、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平均明显高于阴性对照组细胞。转录和蛋白表达水平均表明BT细胞发生了炎症反应，且pro-Caspase-1被切割成为有活性的Caspase-1和Caspase-1p20,pro-IL-1β被切割成有活性的IL-1β。将pCMV-C和pCMV-ASC、pCMV-C和pCMV-NLRP3分别共转染293T细胞，48 h后通过激光共聚焦显微镜观察C蛋白与NLRP3和ASC的共定位。结果显示，C蛋白分别与NLRP3和ASC在细胞质中存在共定位。为进一步探究C蛋白激活NLRP3炎症小体对细胞焦亡的影响，通过qRT-PCR和western blot检测过表达C蛋白的BT细胞中死亡调节蛋白GSDMD mRNA的转录、蛋白表达水平及切割情况。通过扫描电镜观察转染pCMV-C 12 h和24 h的BT细胞，并采用间接ELISA检测转染pCMV-C 24 h BT细胞上清中IL-1β的含量。qRT-PCR结果显示，GSDMD mRNA转录水平极显著高于空白对照组和阴性对照组细胞(P<0.001);GSDMD蛋白的表达水平也明显高于两个对照组，且该蛋白被切割成有活性的GSDMD-N和GSDMD-C。电镜观察结果显示，与阴性对照细胞相比，随着C蛋白表达时间的延长，BT细胞膜逐渐破裂，细胞膜均已形成渗透孔，并有细胞内容物的释放，且细胞上清中IL-1β的含量极显著高于阴性对照组细胞(P<0.01)。上述研究表明，C蛋白能够显著引起NLRP3炎症小体活化进而激活pro-Caspase-1形成活化的Caspase-1，后者一方面切割GSDMD，形成有活性的GSDMD-N，并在BT细胞膜形成孔洞，释放内容物，诱导BT细胞发生细胞焦亡，另一方面活化的Caspase-1切割pro-IL-1β，形成有活性的IL-1β，并释放到BT细胞外，致细胞上清中IL-1β含量极显著升高。本研究为进一步阐明BVDV的致病机制以及制定BVD的防控策略提供参考。
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单位动物科技学院; 浙江农林大学
