人骨肉瘤细胞DNA双链断裂修复γH2AX分析

作者：任来峰; 郭莲娣; 石新丽; 李莎

来源：中华肿瘤防治杂志, 2014, 21(16): 1239-1243.

DOI：10.16073/j.cnki.cjcpt.2014.16.002

• DNA损伤
• γH2AX
• DNA双链断裂
• 基因组稳定性
• 电离辐射

目的:探讨人骨肉瘤细胞U2OS中利用γH2AX分析评价细胞DNA双链断裂(DNA Double-Strand Breaks,DSBs)损伤反应动力学过程。方法:用免疫荧光和蛋白质印迹法结合DNA损伤应答通路抑制剂及siRNA基因沉默技术分析U2OS细胞在遭受DSBs损伤处理前后γH2AX foci和其表达水平的动力学变化,并通过流式细胞术定量分析γH2AX的变化情况。结果:在细胞未经损伤处理时,U2OS细胞仅有极少量的γH2AX foci,而在遭受电离辐射(ionizing radiation,IR)后,γH2AX在损伤部位的募集和表达水平快速升高,1h内达峰值,该过程可被ATM抑制剂和磷酸肌醇激酶3相关激酶抑制剂Wortmannin抑制;而后随着时间的推移,γH2AX表达又逐渐消退,反映了细胞DSBs损伤应答的动力学过程。利用小分子RNA敲除参与DSBs损伤修复的关键因子Mre11表达的细胞及对照siRNA转染细胞,IR处理4h后γH2AX foci数分别为31.68±4.59和21.33±2.08,处理8h分别为21.85±2.49和12.02±4.13,处理12h分别为19.65±2.34和8.51±2.17),处理16h分别为18.05±1.75和6.94±3.19,各时间点Mre11沉默组细胞的γH2AX foci数显著多于对照siRNA处理组细胞,P=0.013,反映了延长的DSBs损伤修复动力学(减缓的γH2AX foci消退)。经γH2AX和PI双染色流式细胞术发现,不同细胞分期γH2AX阳性率差异有统计学意义,G1期细胞在IR处理前为(1.34±0.28)%,处理后为(20.25±3.56)%,P<0.001;S期细胞在IR处理前为(1.26±0.19)%,处理后为(79.48±5.72)%,P<0.001;G2/M期细胞在IR处理前为(8.84±1.25)%处理后为(29.49±4.36)%,P<0.001。结论:γH2AX分析可有效分析U2OS细胞的DSBs损伤应答反应动力学,U2OS细胞具有低γH2AX背景、易于传代培养等优点,可作为研究细胞DSBs损伤应答反应的模式细胞。

• 单位
  河北中医学院; 四川大学华西第二医院; 山西医科大学汾阳学院