本发明公开了一种用于检测动物毛发皮质醇的预处理方法,尤其适用于野生动物毛发中皮质醇提取的预处理方法,包括以下步骤:步骤一:获得毛发样品;步骤二:清洁毛发并去角质化;步骤三:利用液氮磨碎清洁并去角质化后的毛发;步骤四:萃取步骤三中磨碎的毛发;步骤五:离心,取上清,干燥萃取液所得的溶质加入磷酸缓冲盐溶液。本发明提高实验效率、质量和稳定性,并节约了样品的使用量。