Microbulbifer sp. A4B-17菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶与烯醇化酶研究

作者：刘曹彤; 陆依琳; 徐慧; 彭学^*

来源：江苏农业科学, 2021, 49(12): 45-50.

DOI：10.15889/j.issn.1002-1302.2021.12.006

• 对羟基苯甲酸
• 磷酸烯醇式丙酮酸
• 烯醇化酶
• 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶

对羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoate,4HBA)应用广泛,在工业领域上被当作前体合成各种芳香族化合物,其中包括液晶材料、农药等;在食品和化妆品等领域上被当作防腐剂。微泡菌属(Microbulbifer sp.) A4B-17是一种能将葡萄糖合成4HBA的海洋细菌,为了提高4HBA的合成效率对合成莽草酸途径前体的2个关键酶:GM004356编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和GM0031333编码的烯醇化酶(Enolase)进行研究。通过构建蛋白系统进化树发现,PEPCK与Microbulbifer sp. GL-2的PEPCK相似度为95.15%,Enolase与Microbulbifer variabilis的Enolase相似度为98.13%。利用低温表达载体在大肠杆菌中对2个酶进行高效表达,提取和纯化后,采用BCA法蛋白定量计算后得到纯化后的PEPCK和Enolase分别占各自粗酶液的1.304%和1.123%。酶活采用PK/LDH(丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶)偶联检测法检测NADPH的减少量。根据米氏常数双倒数法求得PEPCK和Enolase的Km值分别为0.041 mmol/L和0.056 mmol/L,PEPCK反应的最适温度为30℃,最适pH值为7,Enolase的最适温度为30℃,最适pH值为7。以上结果为高效生产4HBA提供了理论依据。

• 单位
  江苏师范大学; 生命科学学院