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摘要
【目的】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugionsa)二鸟苷酸环化酶SiaD调控着铜绿假单胞菌的生物被膜形成等表型。在研究过表达siaD对生物被膜的调控作用时发现，与野生型siaD基因回补菌株相比，一株回补菌株的生物被膜产量显著升高。本文的目的即是探究该菌株生物被膜产量升高的原因，并对该菌株的其他表型进行研究。【方法】通过测序确定突变位点；利用生物被膜定性和定量实验对发生点突变的菌株表型进行分析；利用Western blotting实验检测SiaDR119M蛋白表达水平；利用GST-pulldown实验检测SiaC蛋白与SiaDR119M蛋白在体外的结合能力；针对siaDR119M点突变基因进行融合蛋白表达载体的构建，表达并纯化该蛋白，利用高效液相色谱检测SiaDR119M的酶活；为了进一步研究c-di-GMP与细菌运动能力的关系，对细菌的运动能力进行检测。【结果】测序比对结果显示，序列的第119个氨基酸发生了突变，由精氨酸突变成了甲硫氨酸。生物被膜定性和定量实验显示，与野生型siaD回补菌株相比，siaDR119M的回补菌株生物被膜产量增加，siaDR119A的回补菌株生物被膜产量低于siaDR119M的回补菌株，siaDR201A回补菌株生物被膜含量显著增加，siaDR119M R201A双突变回补菌株生物被膜的含量低于siaDR201A回补菌株。Western blotting和GST-pull down实验证明，与野生型SiaD蛋白相比，SiaDR119M蛋白表达水平无差别，SiaC和SiaDR119M蛋白之间存在特异的相互作用。高效液相色谱结果显示SiaDR119M蛋白酶活降低。运动能力检测实验中，与siaD野生型回补菌株相比，siaDR119M回补菌株运动能力减弱，siaDR201A、siaDR119M R201A回补菌株运动能力无差别。【结论】siaDR119M突变导致生物被膜合成增强，酶活降低，运动能力减弱。我们推测突变后表型的变化可能是因为突变在体内会影响SiaD蛋白与下游效应蛋白的相互作用，加强了下游效应蛋白的信号传导能力，然而具体机制有待进一步探索。
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