高氧肺损伤幼鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞蛋白质组学变化的相关研究

作者：鲁雪; 汪超; 张超; 肖长雪; 梁木林; 许峰^*

来源：中华危重病急救医学, 2019, (04): 474-479.

• 高氧
• Ⅱ型肺泡上皮细胞
• 蛋白质组学

目的 通过蛋白质组学研究探讨高氧暴露后幼鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)的损伤机制。方法 将早产SD大鼠原代AECⅡ细胞分为常氧组和高氧组,分别置于常氧(21%O2)和高氧(95%O2)中培养24 h,于倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变,用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达水平,以保证高氧模型的成功建立；收集AECⅡ细胞总蛋白,采用串联质谱标签(TMT)标记定量蛋白质组技术检测其蛋白谱,以高氧暴露后差异倍数(FC)>1.5、P<0.05双标准筛选差异蛋白,并对其进行生物信息学分析；依据分析结果,将AECⅡ细胞分为常氧组、高氧组及高氧+MW167组〔细胞置于含95%O2的氧舱前30 min加入10 μmol/L的γ泌肽酶抑制剂MW167〕,培养24 h后,用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性,用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Notch通路下游蛋白毛状蛋白(Hes1)和促凋亡蛋白Bax的mRNA表达。结果 ①光镜下观察,常氧组细胞明显增殖、延展,胞质颗粒物质丰富；高氧组细胞核固缩,胞质内颗粒物质明显减少。与常氧组相比,高氧组细胞caspase-3蛋白表达明显增高,Bcl-2蛋白表达明显降低(caspase-3/GAPDH：1.352±0.086比0.769±0.080,Bcl-2/GAPDH：0.614±0.060比1.361±0.078,均P<0.01)。②蛋白质组学鉴定出差异蛋白162个,其中高氧暴露后上调的差异蛋白主要参与各种刺激的应答,定位于胞外区；高氧暴露后下调的差异蛋白主要与物质合成相关,定位于细胞基质区域。对差异蛋白通路富集分析(KEGG Pathway分析)结果表明,细胞色素P450代谢、线粒体氧化磷酸化、Notch信号通路等可能与高氧损伤AECⅡ细胞机制相关。③与常氧组比较,高氧组AECⅡ细胞活性显著下降,Hes1、Bax mRNA表达水平明显升高〔细胞活性(A值)：0.060±0.003比1.058±0.017,Hes1 mRNA(2-ΔΔCt)：2.235±0.606比1.144±0.107,Bax mRNA(2-ΔΔCt)：2.210±0.240比1.084±0.096,均P<0.05〕。与高氧组比较,高氧+ MW167组细胞活性明显升高,Hes1、Bax mRNA表达水平明显下降〔细胞活性(A值)：0.271±0.025比0.060±0.003,Hes1 mRNA(2-ΔΔCt)：0.489±0.046比2.235±0.606,Bax mRNA(2-ΔΔCt)：1.289±0.041比2.210±0.240,均P<0.05〕。结论 高氧肺损伤幼鼠AECⅡ细胞损伤机制可能与细胞色素P450代谢、线粒体氧化磷酸化等途径的改变以及Notch信号通路的激活有关。

• 单位
  重庆医科大学附属儿童医院