产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达及免疫保护力评价

作者：杜吉革; 薛麒; 朱真; ***; 印春生; 姚文生; 康凯; 陈小云^*

来源：中国兽医学报, 2019, 39(02): 265-280.

DOI：10.16303/j.cnki.1005-4545.2019.02.13

• A型产气荚膜梭α毒素
• 突变
• 重组表达
• 毒力
• 抗原性

对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56和130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcpam4。将Gcpam4克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPAm4。利用Western blot方法检测rCPAm4与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测纯化蛋白的毒力。随后,将rCPAm4与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例混合乳化制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后21d,对家兔通过耳缘静脉注射1个家兔MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rCPAm4对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPAm4主要以包涵体的形式表达,且能与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清反应;小鼠安全性试验显示,5.5mg/kg剂量的rCPAm4对小鼠仍无致死性;免疫rCPAm4后,每毫升的一免抗血清可中和10～20个小鼠MLD、二免抗血清可中和30～50个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%死亡,免疫组家兔得到了100%的保护。以上结果表明,rCPAm4具有良好的安全性和免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。

• 单位
  中国兽医药品监察所