人源DKK1真核悬浮分泌表达系统的建立及其特异性抗体的制备和鉴定

作者：沈秋瑾; 孔娟; 邓云; 蒋华; 胡素文; 孔洁; 倪涛; 游海燕; 李宗海; 屠红; 张志刚; 覃文新

来源：肿瘤, 2011, 31(08): 693-700.

DOI：10.3781/j.issn.1000-7431.2011.08.004

• 细胞培养技术
• 哺乳动物细胞
• 悬浮培养
• Dickkopf-1蛋白
• Free-Style293-F细胞

目的:利用哺乳动物细胞悬浮培养表达系统分泌表达人源Dickkopf-1(DKK1)蛋白,纯化蛋白并制备特异性抗体。方法:构建DKK1真核表达载体pCMVcStrep-DKK1,并借助脂质体将载体瞬时转染入Free-Style293-F细胞(无血清培养),ELISA和蛋白印迹法检测DKK1蛋白表达量。利用亲和层析法纯化DKK1蛋白,Wnt信号通路荧光素酶报告系统检测其生理活性。以纯化的DKK1蛋白免疫BALB/c小鼠获得相应抗体,并初步鉴定其抗原特异性。结果:DKK1蛋白分泌表达在Free-Style293-F细胞培养液中,蛋白浓度在转染后第5天达最高(20mg/L)。所纯化的DKK1蛋白能够抑制Wnt3a蛋白诱导的报告基因的表达。抗DKK1小鼠抗体能特异性识别细胞内源性DKK1蛋白。结论:建立了在哺乳动物细胞悬浮培养系统中高效分泌表达人源DKK1重组蛋白的表达系统,并获得相应的特异性抗体,为其下一步结构与功能研究及在肿瘤中的应用奠定了实验基础。

• 单位
  上海交通大学; 癌基因与相关基因国家重点实验室; 上海市肿瘤研究所