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摘要
G型溶菌酶(G-type lysozyme, G.lys)是一种富含半胱氨酸的天然免疫因子,在无脊椎动物的免疫防御过程中起重要作用。本研究旨在通过揭示法螺(Charonia tritonis) G型溶菌酶(Ct G.lys)重组蛋白的抑菌功能,为进一步认识法螺的分子免疫机理及病害防治提供新思路。首先对Ct G.lys序列进行了分析,利用实时荧光定量PCR检测Ct G.lys的组织分布,然后以p GEX-4T-1为表达载体,构建重组质粒p GEX-4T-1-Ct G.lys,进行重组蛋白表达,并检测了重组蛋白的抑菌活性。结果显示:1)Ct G.lysc DNA的5′非翻译区(UTR)为66bp,3′UTR为186 bp,开放阅读框为789bp,编码262个氨基酸,有1个可溶性转糖苷酶(SLT)结构域(72～255aa),包含6个半胱氨酸残基和3个酶活性催化位点(Glu72、Asp85、Asp96);2)多序列比对及系统发育分析表明,Ct G.lys与亲缘关系较近的福寿螺G型溶菌酶氨基酸的同源性最高;3)Ct G.lys在所有被检测组织中均表达,其中在肝脏、外套膜表达量较高; 4) 16℃, 0.5 mmol/L IPTG诱导表达10 h后,重组蛋白在上清液和包涵体均表达分子量约为51.91 kDa,纯化后得到浓度为1.2 mg/mL的重组蛋白; 5)抑菌实验表明,重组蛋白p GEX-4T-1-Ct G.lys具有抗金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、藤黄微球菌Micrococcus luteus、施罗氏弧菌Vibrio shilonii的活性,对革兰氏阳性细菌的抑菌作用大于革兰氏阴性细菌。研究结果为进一步解析法螺免疫防御的分子机理提供了参考数据和科学依据。
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