利用CRISPR/Cas9技术制备CD163基因SRCR5序列敲除猪

作者：韩晓松; 高杨; 刘海龙; 熊友才; 谢胜松; ***; 李新云; 赵书红; 阮进学^*

来源：农业生物技术学报, 2020, 28(09): 1535-1542.

• CRISPR/Cas9
• CD163 (cluster of differentiation 163)
• SRCR5 (scavenger receptor cysteine-richdomain 5)
• 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)
• 体细胞核移植(SCNT)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是养猪(Sus scrofa)业中的重要传染性疾病之一,CD163 (cluster of differentiation 163)是PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)入侵机体的重要受体,其第7外显子编码的SRCR5 (scavenger receptor cysteine-rich domain 5)是PRRSV侵染细胞的关键结构域。为生产能够抵抗PRRSV的基因编辑猪,本研究利用CRISPR/Cas9技术,同时将靶向猪CD163内含子6和7的2条小向导RNA (small guide RNA, sgRNA)与Cas9表达载体转染大白猪的胎儿成纤维细胞(pig embryonic fibroblast cells,PEFs)。利用有限稀释法挑选32株单克隆细胞,经PCR扩增与测序鉴定,获得SRCR5序列缺失的PEFs,其中纯合敲除效率为6.25%;随后以CD163基因编辑的纯合细胞为供体细胞进行体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT),获得1头正常存活的SRCR5序列缺失猪。本研究通过2条sgRNA精准敲除靶基因的功能结构域,可为相关研究提供方法学参考,所获得的CD163基因编辑猪可用于后续抗病育种研究。

• 单位
  华中农业大学