DGKζ基因RNA干扰慢病毒载体制备及感染结肠癌RKO细胞的干扰效应

作者：姜韬; 马丽园; 李海; 马晓强; 师新荣; 彭志海; 杨银学

来源：宁夏医科大学学报, 2017, 39(01): 9-13+117.

DOI：10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2017.01.03

• 结肠癌
• DGKζ
• RNA干扰
• 慢病毒载体

目的应用RNA干扰技术构建DGKζ基因敲减慢病毒载体,感染结肠癌RKO细胞,观察其抑制DGKζ表达的效率。方法运用Real-time PCR及Western blot检测8株结肠癌细胞中DGKζ基因的表达。针对DGKζ基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA oligo,慢病毒载体酶切,转染备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,再进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的DGKζ基因RNA干扰慢病毒载体。慢病毒感染RKO细胞后,运用Real time PCR和Western blot法检测DGKζ基因的敲减效率。结果 8株结肠癌细胞株中,DGKζ在RKO细胞中的表达丰度最高,满足敲减要求;测序表明重组质粒构建成功;Real-time PCR实验结果显示,在RKO细胞中,相对于感染慢病毒空载体细胞,DGKζ基因的敲减效率均达到70%以上(P<0.05)。Western blot结果显示,RKO细胞和感染慢病毒空载体细胞(Negative control)在124k Da处出现免疫印迹,而干扰敲减DGKζ基因的细胞(sh RNA-DGKζ)则不表达内源性DGKζ蛋白,表明DGKζ基因慢病毒感染有很高的敲减效率。结论成功构建DGKζ基因敲减慢病毒载体,进一步证实了感染结肠癌RKO细胞的特异性干扰效应。

• 单位
  上海交通大学; 宁夏医科大学总医院