利用CRISPRi技术敲低海分枝杆菌PPE13基因

作者：王垚垚; 毕斯琪; 陈标; 宋厚辉^*; 杨杨^*

来源：中国兽医学报, 2023, 43(08): 1670-1676.

DOI：10.16303/j.cnki.1005-4545.2023.08.12

• CRISPRi
• 海分枝杆菌
• PPE13
• 敲低

为研究分枝杆菌PPE13基因在宿主细胞的生物功能，本试验利用成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference, CRISPRi)构建海分枝杆菌PPE13诱导型敲低菌株。CRISPRi主要包括表达失活的Cas9蛋白(dead cas9,dCas9)和特异性单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),通过形成复合体特异性识别相应DNA序列并抑制目的基因的转录。用无水四环素(anhydrotetracycline, ATC)诱导海分枝杆菌PPE13诱导型敲低菌株，提取细菌RNA,利用定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)技术检测dCas9、PPE13基因的表达情况，观察细菌在不同时间D600 nm的变化，分析诱导剂质量浓度和目的基因转录水平之间的关系。使用PPE13敲低菌株感染巨噬细胞并检测胞内菌的存活情况。结果表明，在ATC诱导后，dCas9表达水平显著增高。针对PPE13基因设计的4个sgRNA中，sgRNA1对PPE13基因转录的抑制作用最为明显，为70%～90%。生长曲线结果显示，敲低PPE13菌株在48 h内D600 nm无明显变化。诱导剂的质量浓度越高，对PPE13基因的转录水平的抑制作用越强。敲低PPE13可降低细菌在细胞内的增殖能力。本研究构建了海分枝杆菌PPE13敲低菌株，为深入研究分枝杆菌PPE13感染宿主细胞的致病机制奠定了基础。

• 单位
  动物科技学院; 浙江农林大学