秦川牛PDHB基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

作者：张愈; 王晓宇; 周兴; 邱菊; 昝林森; 李安宁^*

来源：中国牛业科学, 2022, 48(04): 1-10.

• 秦川牛
• PDHB基因
• 腺病毒
• 肌内前体脂肪细胞

[目的]旨在通过构建秦川牛丙酮酸脱氢酶β亚基(pyruvate dehydrogenaseβsubunit,PDHB)基因的重组腺病毒载体，为研究PDHB基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的功能做准备。[方法]根据牛PDHB基因mRNA序列(GenBank Accession No.NM＿001035435)设计引物，克隆该基因的编码区(coding sequence, CDS)序列。测序验证后将其重组到穿梭载体pAdTrack-CMV上，经PmeⅠ线性化后，转化到含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的E.coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组，以获得重组质粒pAd-PDHB。再将经PacⅠ酶切线性化的pAd-PDHB转染到HEK 293A细胞中，进行病毒包装并扩增高滴度病毒Ad-PDHB,绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定病毒滴度。将高浓度的Ad-PDHB病毒感染牛肌内前体脂肪细胞，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PDHB的表达量。[结果]经测序验证，实验克隆获得的牛PDHB基因CDS与数据库GenBank收录的序列一致。将PDHB基因CDS与穿梭载体pAdTrack-CMV重组并转染HEK 293A细胞后成功获得了重组腺病毒Ad-PDHB,其滴度为1.66×109 PFU/mL。腺病毒Ad-PDHB侵染牛肌内前体脂肪细胞后，PDHB在mRNA的表达水平比对照组高25.5倍。[结论]成功克隆秦川牛PDHB基因，并构建重组腺病毒质粒pAd-PDHB,获得能够在牛肌内前体脂肪细胞中过表达PDHB基因的高滴度重组腺病毒Ad-PDHB。

• 单位
  西北农林科技大学; 动物科技学院; 国家肉牛改良中心